Einfluss von Oxyfluorfen auf den mRNA-Gehalt

Durch Oxyfluorfenbehandlung wurde die Gesamtenzymaktivität der Catalase nicht verändert (Abbildung 7, S. 39). Auf mRNA-Ebene hingegen zeigten die einzelnen Isoformen eine differenzierte Regulation (Abbildung 17).

BelW3 BelW3gor

CAT1

CAT2

CAT3

0 0,05 0,1 0,25 0,5 1 µM 0 0,05 0,1 0,25 0,5 1 µM Oxyfluorfen

0 0,5 µM Oxyfluorfen Dunkel

Abbildung 17: mRNA der Catalasen aus BelW3 und BelW3gor nach Oxyfluorfenbehandlung.

Die Gesamt-RNA des Wildtypes BelW3 und der Transformante BelW3gor wurde im selben Gel aufgetrennt, geblottet und die mRNA mit Sonden gegen die Catalase-Isoformen CAT1, CAT2 und CAT3 detektiert. Als Proben dienten zwei Monate alte Tabakpflanzen, die für drei Tage mit verschiedenen Konzentrationen an Oxyfluorfen (0; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 und 1 µM) im Licht oder im Dunkeln (0 und 1 µM) behandelt wurden. Zur besseren Übersicht wurden die auf einem Northern Blot entwickelten Transkriptmengen nach Kultivar separiert abgebildet.

Die CAT1-mRNA wurde durch Oxyfluorfengabe sehr stark reprimiert. Dieser Effekt trat so-wohl im Wildtyp als auch in der GR überexprimierenden Transformante auf, obgleich hier eine etwas abgeschwächte Antwort auftrat. Gegensätzlich zur CAT1 wurde die mRNA der CAT2 nach Oxyfluorfenbehandlung konzentrationsabhängig stark erhöht. Die Isoform CAT3 zeigte keine Reaktion auf den Diphenylether, besaß aber im Dunkeln eine höhere Transkriptmenge als im Licht.

Die zeitliche Abfolge der H2O2-abbauenden Enzyme APX und CAT wurde über den Behand-lungszeitraum von drei Tagen verfolgt. Um den Effekt dirunaler Schwankungen auszu-schliessen, wurden die Proben jeweils zur gleichen Tageszeit genommen. Die APX-mRNA

wurde innerhalb von 24 h durch Oxyfluorfen maximal induziert (Abbildung 18). Veränderun-gen im mRNA Gehalt der Catalasen traten erst nach zweitägiger Oxyfluorfengabe auf.

APX

CAT2 CAT1

K K Oxy

0 h 24 h 48 h 72 h K Oxy K Oxy

Abbildung 18: Kinetik der mRNA-Veränderung von Ascorbatperoxidase, Catalase1 und Catalase2 bei Oxyfluorfenbehandlung von BelW3.

Die Gesamt-RNA des Wildtypes BelW3 wurde aus zwei Monaten alte Tabakpflanzen bei Behandlung mit 0,5 µM Oxyfluorfen (Oxy; unbehandelte Kontrolle: K) zu den angegebenen Zeitpunkten extrahiert (0 h, 24 h, 48 h und 72 h nach Behandlungsbeginn).

Die mRNA der cytosolischen Ascorbatperoxidase erfuhr durch Behandlung der Tabakpflanzen mit Oxyfluorfen eine starke, konzentrationsabhängige Induktion (Abbildung 19). Um zwischen Veränderungen im Expressionsniveau durch Oxyfluorfen selbst und durch Oxyfluorfen-bedingten oxidativen Stress unterscheiden zu können, wurden Parallelansätze im Licht und im Dunkeln gehalten. Die cytAPX-mRNA wurde im Dunkeln weitaus schwächer als im Licht exprimiert und bei Oxyfluorfenbehandlung nicht verändert exprimiert. Unter Oxyfluorfengabe bei Belichtung trat eine starke und konzentrationsabhängige Induktion der APX-mRNA auf.

Die Menge an mRNA war in den beiden Tabaklinien vergleichbar, wenn auch die APX-mRNA unter cytosolischem Stress durch Oxyfluorfen in der Transformante etwas stärker induziert wurde als im Wildtyp.

Auch die mRNA-Menge der GPX zeigte eine konzentrationsabhängige Steigerung bei Oxyfluorfengabe unter Belichtung. Im Gegensatz zu der beobachteten verminderten Ex-pression der APX-mRNA im Dunkeln war bei der GPX kein Unterschied in der Transkription im Licht und Dunkel manifest.

Ferner wurde die Expression der in BelW3gor überexprimierten bakteriellen Glutathion-reduktase GOR nachgeprüft (Abbildung 19). Die pflanzliche, endogene GlutathionGlutathion-reduktase GR weist eine zu geringe Homologie zur bakteriellen GOR auf, um unter den gewählten

Bedingungen kreuzreagieren zu können. Im Wildtyp war mit der spezifischen Sonde der GOR cDNA kein Genprodukt nachweisbar. In der Transformante hingegen konnte die bakterielle GOR mithilfe der Sonde nachgewiesen werden. Obgleich das transformierte Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven viralen Promotors steht, trat durch Behandlung mit Oxyfluorfen eine leichte Induktion der GOR auf.

APX

GOR

Dunkel

GPX

0 0,5 Dunkel

BelW3 BelW3gor

0 0,05 0,1 0,25 0,5 1 µM 0 0,05 0,1 0,25 0,5 1 µM 0 0,5 0 µM Oxyfluorfen Hell

Abbildung 19: mRNA der Ascorbatperoxidase, der Glutathionperoxidase und der bakteriellen Glutathionreduktase in BelW3 und in BelW3gor nach Behandlung mit Oxyfluorfen.

Der Wildtyp BelW3 und die Transformante BelW3gor mit Überexpression der bakteriellen Glutathion-reduktase (jeweils zwei Monate alte Pflanzen) wurden für drei Tage mit Oxyfluorfen im Licht (Konzentrationen 0; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 und 1 µM) bzw. im Dunkeln (Konzentrationen 0 und 0,5 µM) be-handelt. Die Veränderung im mRNA-Gehalt der Ascorbatperoxidase (APX), der Glutathionperoxidase (GPX) und der bakteriellen Glutathionreduktase (GOR) wurde über Northern Blots nachgewiesen, wobei die Trennung der Kultivare und die Abtrennung der GPX-Dunkelproben nur optischer Natur ist. Die Dunkelproben der APX wurden auf einer getrennten Membran nachgewiesen, weswegen hier eine zusätzliche unbehandelte Lichtkontrolle aufgetragen wurde, um einen Vergleich zu ermöglichen.

Analog zur Induktion des PR1a unter Paraquatstress wurde auch bei Oxyfluorfenbehandlung eine verstärkte Transkription des PR1a nachgewiesen, wobei das mRNA-Niveau im Wildtyp etwas höher lag als in der transgenen Pflanze (Abbildung 20).

Des Weiteren wurde überprüft, ob die - durch Oxyfluorfen auf enzymatischer Ebene inhibierte - (plastidäre) Protoporphyrinogenoxidase eine kompensatorische Induktion erfährt.

Die PPOX besaß im Dunkeln eine geringere Expression als im Licht. Durch Oxyfluorfen wurde ihre mRNA nicht verstärkt induziert.

PR1a

PPOX

0 0,5

Dunkel Dunkel

0 0,05 0,1 0,25 0,5 1 µM 0 0,05 0,1 0,25 0,5 1 µM Oxyfluorfen

0 0,5 µM Oxyfluorfen

BelW3 BelW3gor

Abbildung 20: mRNA des Pathogenesis Related Protein 1a und der Protoporphyrinogenoxidase bei Be-handlung von BelW3 und BelW3gor mit Oxyfluorfen.

Die mRNA-Gehalte des Pathogenesis Related Protein 1a (PR1a) und der Protoporphyrinogenoxidase (PPOX) wurden in zwei Monate alten Tabakpflanzen nach Oxyfluorfenbehandlung im Licht (Konzen-trationen 0; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 und 1 µM) bzw. im Dunkeln (Konzen(Konzen-trationen 0 und 0,5 µM) nach-gewiesen. Die resultierenden Northern Blots wurden optisch in der Darstellung der Kultivare BelW3, BelW3gor und der jeweiligen Licht- und Dunkelbehandlungen getrennt.

Nach Oxyfluorfenbehandlung zeigte die plastidäre Isoform der SODs, die chlFeSOD, kaum eine Veränderung (Abbildung 21). Ein Hinweis auf die Regulation der chlFeSOD ergab sich aus dem Vergleich der Transkriptionsmenge von belichteten und dunkeladaptierten Pflanzen.

Im Licht wurde die chlFeSOD stark induziert, im Dunkeln hingegen war das Genprodukt nicht nachweisbar.

Die mRNA der cytCuZnSOD wurde, wie aus Abbildung 21 ersichtlich, in den Tabaklinien in unterschiedlichem Maße gebildet. BelW3 besaß konstitutiv einen höheren Gehalt an cytCuZnSOD-mRNA, der nach Oxyfluorfenbehandlung kaum erhöht wurde. Demgegenüber war diese SOD-Isoform in BelW3gor in unbehandelten Kontrollpflanzen zwar in geringerer Menge vertreten, wurde aber durch Diphenylethergabe leicht induziert.

chlFeSOD

cytCuZnSOD

Dunkel

BelW3 BelW3gor

0 0,05 0,1 0,25 0,5 1 µM 0 0,05 0,1 0,25 0,5 1 µM 0 0,5 µM Oxyfluorfen Dunkel

0 0,5 µM

Abbildung 21: mRNA der plastidären Fe-Superoxiddismutase und der cytosolischen CuZn-Superoxid-dismutase nach Oxyfluorfenbehandlung von BelW3 und BelW3gor.

Die Gesamt-RNA des Wildtypes BelW3 und der Transformante BelW3gor wurde im selben Gel aufgetrennt, geblottet und die mRNA mit Sonden gegen die plastidäre Fe-Superoxiddismutase (chlFeSOD) und die cytosolische CuZn-Superoxiddismutase (cytCuZnSOD) detektiert. Als Proben dienten zwei Monate alte Tabakpflanzen, die für drei Tage mit verschiedenen Konzentrationen an Oxyfluorfen (0; 0,05; 0,1;

0,25; 0,5 und 1 µM) im Licht oder im Dunkeln (0 und 1 µM) behandelt wurden. Zur besseren Übersicht wurden die auf einem Northern Blot entwickelten Transkriptmengen nach Kultivar und Inkubation separiert abgebildet.

CAT1

CAT2

Para

K Oxy

bhy

Samsun BelW3

Para

K Oxy

K Adult

Abbildung 22: mRNA der Catalase1, der Catalase2 und der â-Carotinhydroxylase in Keimlingen von BelW3 und Samsun.

Keimlinge (14 Tage alt) wurden für 3 Tage mit 100 nM Oxyfluorfen (Oxy) oder1 µM Paraquat (Para) be-handelt und die mRNA der Catalasen1 und 2 (CAT1 bzw. CAT2) und der â-Carotinhydroxylase (bhy) nachgewiesen. Auf der Membran der CAT1-Proben war als zusätzliche Probe die RNA zwei Monate alter, unbehandelter Pflanzen (K Adult) aufgetragen.

3.1.7 Induktion antioxidativer Schutzenzyme in verschiedenen