3.2 Langzeitstudie
3.2.2 Mortalität und begleitende Beobachtungen
Im Lauf des beinahe zweijährigen Versuchszeitraums traten Befunde auf, die neben den ausgewerteten Testparameter Hinweise auf die Wirkung von exo-genen Hormonen und hormonähnlichen Substanzen lieferten.
Die Behandlung der Kaulquappen mit E2 (10-7 M) während der larvalen Entwicklung wies eine niedrige Mortalitätsrate auf, die den für diese Entwick-lungsphase üblichen Ausfällen entsprach. Für Tiere mit abgeschlossener Metamorphose war diese Konzentration des estrogenen Hormons offensicht-lich toxisch. Unabhängig vom Geschlecht begannen die juvenilen Frösche, vermehrt Flüssigkeit im Körper anzusammeln, was zunächst zu einer starken Zunahme des Körpervolumens und schließlich zum Tod führte (Abb. 3.8 A).
Von diesem Phänomen waren sowohl die Tiere betroffen, die bereits vor und während ihrer Metamorphose unter E2-Einfluss standen, als auch jene, de-ren Exposition gegenüber E2 erst nach der Metamorphose begonnen wurde.
Abb. 3.8: (A) Juveniles Tier, dessen Körper durch die Behandlung mit 17β-Estradiol (10-7 M), die erst nach Abschluss der Metamorphose begann, stark auf-gedunsen ist (B). Durch die Behandlung mit Methyltestosteron (10-8 M) hervorgerufene Dunkelfärbung der Vorderextremitäten von juvenilen Tie-ren
Adulte männliche und weibliche Tiere der Art Xenopus laevis besitzen unter-schiedliche Phänotypen. So sind bei den körperlich größeren Weibchen Klo-akenfalten zu finden, während sich bei den kleineren Männchen die Innensei-ten der VorderextremitäInnensei-ten bei Paarungsbereitschaft dunkel färben. Diese sekundären Geschlechtsmerkmale treten im Rahmen einer normalen sexuel-len Entwicklung erst kurz vor oder mit Erreichen der Geschlechtsreife auf.
A B
Bei den Tieren, die mit E2 (10-7 und 10-8 M) behandelt wurden, waren Kloakenfalten bereits kurz nach Abschluss der Metamorphose zu beobach-ten. Wie die Untersuchung der Gonaden am Versuchsende zeigte, wurden diese Kloakenfalten unter dem Einfluss exogenen 17β-Estradiols auch von männlichen Tieren entwickelt.
In den mit Testosteron behandelten Becken konnten vereinzelt Tiere mit dunkel gefärbten Innenflächen der Vorderextremitäten beobachtet wer-den, während dies bei allen juvenilen Fröschen der Fall war, die gegenüber Methyltestosteron exponiert wurden (Abb. 3.8 B). Auch dieses Merkmal trat unabhängig davon auf, ob es sich um männliche oder weibliche Tiere han-delte.
3.2.3 Histologie
Der Krallenfrosch X. laevis ist aufgrund der langen Zeitspanne von bis zu zwei Jahren, die zwischen dem Abschluss der Metamorphose und dem Er-reichen der Geschlechtsreife liegt, ungeeignet für Studien, die eine Beein-flussung der Reproduktionsleistung anhand von Laicherfolg oder Ertrag an Jungtieren messen. Um dennoch einen Eindruck über die mögliche Beein-trächtigung der Fertilität von langfristig gegenüber potenziell endokrin wirk-samen Substanzen exponierten Tieren zu erhalten, wurden die Gonaden der Individuen aus der Langzeitstudie histologisch untersucht.
Die vorliegenden Tierzahlen pro Behandlungsgruppe am Ende des Ex-postitionszeitraums waren stark unterschiedlich und z.T. recht gering. Dar-über hinaus ließ die fehlende Kenntnis, welche histologisch beobachtbaren Veränderungen tatsächlich relevante Beeinträchtigungen des Reprodukti-onserfolgs nach sich ziehen, die verlässliche Definition eines adversen Er-scheinungsbildes nicht zu. Aus diesen Gründen konnte eine statistische Auswertung von auftretenden Abweichungen im Vergleich zu den unbehan-delten Kontrollansätzen nicht durchgeführt werden.
Die folgenden Darstellungen (Abb. 3.9 und 3.10) zeigen beispielhaft auffällige Befunde, wie sie im mikroskopischen Bild der Gonaden nach den verschiedenen Behandlungen auftraten.
Abb. 3.9: Histologische Abbildungen von Ovarien etwa 20 Monate alter Xenopus:
(A) unbehandelte Kontrolle, frühe Oocytenstadien, 100x (B) unbehandelte Kontrolle, reifere Oocyten, 100x, (C) Dauerexposition mit E2 10-7 M, 100x (D) Exposition nach Abschluss der Metamorphose mit MT 10-8 M, 100x (E) Exposition nach Abschluss der Metamorphose mit TAM 10-7 M, 100x (F) Dauerexposition mit TAM 10-7 M, 100x, Maßstäbe entsprechen 20 µm.
Im Vergleich zu normal entwickelten Ovarien (Abb. 3.9 A und B) wurden ver-schiedenartige Veränderungen im Gewebe nach Behandlung beobachtet.
So führte die bereits im Kaulquappenstadium einsetzende Behandlung mit E2 (10-7 M) zu Oocyten, die eine undeutlicher gegliederte Struktur
auf-A B
C D
E F
A B
C D
E F
A B
C D
E F
wiesen. Sowohl die Kern- als auch die Zellgrenzen offenbarten eine auffällig geringe Konturierung (Abb. 3.9 C).
Bei weiblichen Tieren, die nach Abschluss der Metamorphose mit ei-nem Androgen (MT, 10-8 M) behandelt wurden, ließen sich überwiegend O-varien beobachten, die in ihrer Reifung retardiert erschienen und neben defi-zitärem Wachstum auch in der Entwicklung vergleichsweise zurückgeblieben waren (Abb. 3.9 D).
Die Wirkung der Exposition gegenüber dem Antiestrogen TAM (10-7 M) äußerte sich in erster Linie in vergleichsweise unterentwickelten Ovarien (Abb. 3.9 E), die sowohl in Tieren zu beobachten waren, die während ihrer gesamten Entwicklung in Kontakt mit TAM waren, als auch bei solchen, die erst als juveniler Frosch mit bereits angelegtem Eierstock mit TAM in Berüh-rung kamen. Zusätzlich bleibt festzustellen, dass Tiere in Einzelfällen normal große Ovarien ausbildeten, deren Oocyten jedoch auffällige Läsionen im Dot-terbereich zeigten (Abb. 3.9 F).
Das Hodengewebe männlicher Tiere zeigte sich durch die Behandlun-gen insgesamt weniger stark verändert.
Verglichen mit normal entwickelten Testes (Abb. 3.10 A und B) wiesen die Individuen, die unter dauerhaftem Einfluss von MT (10-8 M) standen, klei-nere Keimdrüsen auf. Darüber hinaus waren im histologischen Bild vereinzelt Läsionen im Gewebe zu erkennen, die in den Kontrolltieren nicht auftraten (Abb. 3.10 C). Die Untersuchung mit höherer Vergrößerung wies dagegen nach, dass sich Hoden von androgen- und unbehandelten Tieren in der de-taillierten Betrachtung kaum voneinander unterscheiden (Abb. 3.10 D). Dies wird bestätigt und gilt in gleicher Weise für männliche Frösche, die seit ihrer Kaulquappenphase gegenüber Testosteron (10-8 M) exponiert waren (Abb.
3.10 F).
Die Behandlung mit E2 (10-8 M) zog dagegen massivere Veränderun-gen nach sich, auch wenn mit ihr erst nach Abschluss der Metamorphose begonnen wurde. Unter estrogenem Einfluss kam es zu Läsionen im Gewe-be, die vermehrt sowie in stärkerem Umfang auftraten und so insgesamt zu z.T. deutlichen Vergrößerungen des Hodens führten (Abb. 3.10 E).
Abb. 3.10: Histologische Abbildungen von Testes etwa 20 Monate alter Xenopus:
(A) unbehandelte Kontrolle, 100x (B) unbehandelte Kontrolle, 400x (C) Dauerexposition mit MT 10-8 M, 100x (D) Dauerexposition mit MT 10-8 M, 400x (E) Exposition nach Abschluss der Metamorphose mit E2 10-8 M, 100x (F) Dauerexposition mit T 10-8 M, 400x, Maßstäbe entsprechen:
A, C, E: 20 µm, B, D, F: 5 µm