Tris-HCl-Puffer (direkt vor Gebrauch frisch anzusetzen):
Tris-HCl 20 mM (Boehringer, Ingelheim)
Saccharose 250 mM (Merck, Darmstadt)
Na2-Molybdat 10 mM (Merck, Darmstadt)
Dithiothreitol (DTT) 5 mM (Boehringer, Ingelheim)
Aktivkohlesuspension:
Tris-HCl-Puffer 20 mM
Aktivkohle Norit A, 4-7 µm 3,75 % (Boehringer, Ingelheim) Dextran T 70 0,375 % (Roth, Karlsruhe)
Hormonlösung (radioaktiv):
[3H]-17β-Estradiol, 51 Ci/mmol (Amersham, Braunschweig)
Ethanol, 5% (Merck, Darmstadt)
Szintillationscocktail Ultima Gold (Canberra-Packard, Frankfurt)
Durchführung
Zwei frisch entnommene Xenopus-Leberhälften wurden unverzüglich in eis-kalten Tris-HCl-Puffer überführt und gewogen. Der anschließenden mechani-schen Zerkleinerung der Leber folgten zwei Waschschritte mit wiederum eis-kaltem Tris-HCl-Puffer zur Blutentfernung, worauf die Leberstücke im glei-chen Puffer aufgenommen (6 mL/g Gewebe) und mit Hilfe eines
motorbetrie-benen Teflon-Pistills (Braun, Melsungen) in einem Glasplottergefäß bei 1000 U/min in 10-15 Wiederholungen homogenisiert wurden.
In einem ersten Zentrifugationsschritt wurde die Suspension zunächst 15 min bei 12 000 g und 4°C zentrifugiert (Centrikon T-124, Rotor 12.24, Kontron, Neufahrn), ehe der Transfer des Überstandes (ohne die Lipidfrak-tion) in die Ultrazentrifuge erfolgte (Ultrazentrifuge TGA, Kontron, Neufahrn), in der dieser für eine Stunde bei 100 000 g und 4°C verblieb. Die gewünsch-ten cytosolischen Estrogenrezeptoren waren im Überstand dieser abschlie-ßenden Zentrifugation enthalten, welcher zur weiteren Verwendung abgezo-gen wurde. Die Untersuchunabgezo-gen des Kompetitionsverhaltens wurden in se-paraten Wiederholungen mit dem Cytosol von je drei Männchen und Weib-chen durchgeführt.
Die im Rahmen der Kompetitionsstudien verwendeten Inkubationsan-sätze enthielten jeweils 25 µL [3H]-17β-Estradiol zur Einstellung einer End-konzentration von 15 nM im Ansatz, 150 µL Puffer, 100 µL Lebercytosol und 10 µL Probengut. Als Probengut wurden parallel zu einer Konzentrationsrei-he von 10-9 bis 10-3 M unmarkierten 17β-Estradiols eine Verdünnungsreihe des 1 000fach angereicherten Extraktes inkubiert, die auf die 0,7x, 3,5x, 17,5x bzw. 35x Konzentrierungsstufe des Ausgangsmediums eingestellt wurde. Dies erlaubte einen Vergleich des kompetitiven Verdrängungspotenti-als der Extraktinhaltsstoffe mit dem des natürlichen Liganden.
Die Inkubation der Ansätze erfolgte für 24 h bei 4°C. Danach wurden je 300 µL Aktivkohlesuspension zu den Proben gegeben und gevortext, um rezeptorgebundene Estrogene von frei in der Lösung vorhandenen abzu-trennen. Letztere wurden von der Aktivkohle absorbiert und in einem Zentri-fugationsschritt (3 750 g, 15 min) abgetrennt. Ein 300 µL Aliquot des Über-standes wurde zu 3 mL Szintillationscocktail gegeben und zur Messung in einen Flüssigkeitsszintillationszähler (LSC, Tri Carb 300, Packard) gebracht.
Die Menge an hormonartigen Inhaltsstoffen des Extraktes mit Bin-dungsfähigkeit zum Estrogenrezeptor wurde auf folgende Weise berechnet.
Aus den Kompetitionsdaten der 17β-Estradiol-Referenzkonzentra-tionen (10
-9 – 10-5 M) wurde nach Transformation in einen logit-log-Plot eine Regressi-onsgerade erstellt. Der Schittpunkt dieser Geraden mit der x-Achse gibt den IC50-Wert für den natürlichen Liganden 17β-Estradiol an. Der IC50-Wert stellt die rechnerisch ermittelte Konzentration dar, bei der die Hälfte des gebunde-nen radioaktiven Liganden durch nicht markiertes 17β-Estradiol verdrängt wurde.
Parallel zur Konzentrationsreihe des 17β-Estradiol wurden verschiede-nen Anreicherungsstufen der natürlichen Medien auf ihr Verdrängungspoten-zial hin untersucht. Dazu wurden die zunächst 1 000 fach angereicherten Extrakte (siehe Kapitel 2.6) 1 : 50, 1 : 10, 1 : 2 und unverdünnt im RARA
ein-gesetzt. Durch die Verdünnung im experimentellen Ansatz ergaben sich hieraus Konzentrierungsstufen von 0,7x; 3,5x; 17,5x und 35x. Analog zu dem für den natürlichen Liganden beschriebenen Vorgehen wurde für die Extrakte der Konzentrierungsfaktor berechnet, bei dem die Hälfte aller Rezeptoren aufgrund der Verdrängung durch die Inhaltsstoffe des Extraktes nicht mehr mit dem radioaktiven Liganden besetzt sind. Der Quotient von IC50-Wert des 17β-Estradiols und dem errechneten Konzentrationsfaktor gibt das Potenzial der Extrakte in Estradioläquivalenten an, mit dem die enthaltenen Substan-zen an den cytosolischen Estrogenrezeptor der Leber von Xenopus laevis binden können.
2.6 E XTRAKTION
Um die Inhaltsstoffe komplexer Matrizes auf ein Konzentrationsniveau anzu-reichern, das eine Prüfung in den bereits beschriebenen Bioassays zuließ und darüber hinaus den Versuch zu unternehmen, eine einfachere, aber e-benso verlässliche Alternative zu aufwändigen Freilanduntersuchungen an-zubieten, wurden Extrakte der auch anderweitig im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Medien angefertigt und zur Analyse herangezogen.
Im Fokus des Interesses standen lipophile Stoffe, deren Anreichung über eine C18-Festphasenextraktion möglich ist. Die langkettigen, aliphati-schen Reste des Sorbens halten beim Durchlauf eines Mediums hydrophobe Substanzen zurück, die im Anschluss eluiert und so für den weiteren Einsatz in experimentellen Untersuchungen verfügbar gemacht werden können.
Medien und Chemikalien
Proben von Oberflächengewässsern Bakerbond spe glas columns
mit PTFE-Fritten, 8 mL, 2 g C18 (Baker, Deventer, Niederlande) Chromabond C18ec Polypropylensäulen
70 mL, 10g Sorbens (Macherey & Nagel, Düren) Methanol, gradient grade (Merck, Darmstadt)
Wasser, HPLC grade (Merck, Darmstadt)
Ethanol, gradient grade (Merck, Darmstadt)
Durchführung
Das Probenvolumen des zu extrahierenden Mediums lag abhängig von der notwenigen Extraktmenge für das Experiment, in dem diese untersucht wer-den sollten, bei 2 oder 100 L. Für die 2 L-Proben wurwer-den Bakerbondsäulen benutzt, während die Extraktion des größeren Volumens mit Chromabond-Säulen durchgeführt wurde. Vor dem Probenkontakt wurden die Chromabond-Säulen mit Methanol konditioniert. Nach einem abschließenden Waschschritt mit Was-ser war die Vorbereitung der Kartuschen für die Extraktion beendet.
Die Proben wurden mit einer Durchflussrate von etwa 10 mL/min auf die Säulen gegeben. Um den Durchfluss zu unterstützen und zu beschleuni-gen, saßen die Säulen einer Unterdruckkammer (Column Processor spe 12G, Baker, Deventer, Niederlande) auf. Nachdem das gesamte Probenvo-lumen die Kartusche passiert hatte, erfolgte ein abschließender Spülschritt mit Wasser und die Trocknung des Sorbens unter einem Stickstoffstrom.
Mit Hilfe von Methanol wurden die lipophilen Bestandteile vom C18-Trägermaterial eluiert und in einem Glasgefäß aufgenommen. Die auf diese Weise erhaltenen Extrakte wurden mit Stickstoff abgeblasen und so bis zur Trockenheit eingeengt. Die Wiederaufnahme der Substanzen in dem für den Einsatz in Bioassays geeigneten Träger Ethanol erfolgte unter anoxischen Bedingungen. Hierzu wurde den Proben in Stickstoffatmosphäre (Microflow Anaerobic System Mk 2, MDH, Andover, GB) ein Volumen des Alkohols zu-gegeben, das so gewählt war, dass sich nach dem Lösen der Extrakte eine 1000fache Anreicherung der lipophilen Inhaltsstoffe in Bezug auf das Aus-gangsmedium einstellte. Ein optimaler Wiederlösungsgrad der extrahierten Substanzen wurde durch zweitägiges Schütteln bei etwa 200 rpm sicherge-stellt. Die Lagerung der Extrakte erfolgte bei 4°C.