2.6.1 Präparation genomischer DNA
Die Präparation genomischer DNA erfolgte aus frischem Pflanzenmaterial mit Hilfe des peqGOLD Plant DNA Mini Kits (PEQLAB, Erlangen) gemäß Anleitung des Herstellers. Das zugrunde liegende Prinzip besteht in der chemischen Lyse der Proben und der anschlie-ßenden Isolation und Aufreinigung der genomischen DNA über eine Silikamembran.
Zellbestandteile, Proteine und sekundäre Metabolite werden durch ein spezielles Puffer-system entfernt und die DNA anschließend eluiert.
2.6.2 Präparation pflanzlicher RNA
Die Präparation pflanzlicher RNA erfolgte aus frischem Pflanzenmaterial mit Hilfe des NucleoSpin® RNA Plant Kits (Macherey-Nagel, Düren) gemäß Anleitung des Herstellers, das zugrunde liegende Prinzip ist in 2.6.1 beschrieben.
2.6.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Die Bestimmung der photometrischen Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren im Anschluss an die Präparation erfolgte mit Hilfe eines NanodropTM2000c Spektropho-tometers (Thermo Fisher Scientific, Schwerte). Das Prinzip beruht auf der spezifischen
Absorption der DNA bzw. RNA bei 260 nm. Die Berechnung der Nukleinsäurekonzentra-tion einer Lösung erfolgt gemäß nachstehender Formel:
Formel 1: Berechnung der Nukleinsäure-Konzentration einer Lösung
c: Konzentration der Nukleinsäuren, OD260: optische Dichte bei 260 nm, V: Verdünnungsfaktor, F: Multi-plikationsfaktor (50 für dsDNA, 40 für RNA)
𝑐 [µ𝑔
𝑚𝑙] = 𝑂𝐷260 × 𝑉 × 𝐹
Zusätzlich wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen, aus der Kombination der beiden OD-Werte lässt sich eine Aussage über mögliche Proteinkonta-minationen der Probe ableiten. Liegen die Werte des Verhältnisses OD260/OD280 zwi-schen 1,8 und 2,0 lässt dies auf einen hohen Reinheitsgrad der Probe schließen.
2.6.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) zur Amplifikation ge-nomischer DNA-Bereiche wurde mit Hilfe des KAPA2G® Fast 2x ReadyMix with Dye (PEQLAB, Erlangen) gemäß Anleitung des Herstellers durchgeführt.
Die Amplifikation von DNA-Bereichen für eine nachfolgende Klonierung erfolgte mit Hilfe der Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific, Schwerte) in einem Primus 96 advanced Thermocycler (PEQLAB, Erlangen). Die Zusammensetzung der Reaktionsansätze und die Temperatureinstellungen des Cyclers sind in den nachfol-genden Tabellen angegeben.
Tabelle 1: Zusammensetzung des PCR Reaktionsansatzes einer PCR mit KAPA2G® Fast Polymerase
Reagenz Volumen Konzentration (final)
2 x KAPA2G® Fast ReadyMix with Dye 12,5 µl 1 x
Forward Primer (50 µM) 1,25 µl 0,5 µM
Reverse Primer (50 µM) 1,25 µl 0,5 µM
Template DNA ≤ 250 ng wie benötigt
Reinstwasser bis 25 µl -
Tabelle 2: Temperaturprogramm des Thermocyclers einer PCR mit KAPA2G Fast Polymerase
Reaktionsschritt Temperatur [°C] Dauer
Initiale Denaturierung 95 2 min
PCR-Amplifikation (35 Zyklen)
Denaturierung 95 15 s
Hybridisierung Primer-spezifisch 30 s
Elongation 72 5s /kbp
Finale Elongation 72 5 min
Tabelle 3: Zusammensetzung des PCR Reaktionsansatzes einer PCR mit Phusion® High-Fidelity Polymera-se
Reagenz Volumen Konzentration (final)
5x Phusion® HF Buffer 4 µl 1 x
10 mM dNTPs 1 µl jeweils 200 µM
Forward Primer (50 µM) 1,25 µl 0,5 µM
Reverse Primer (50 µM) 1,25 µl 0,5 µM
Template DNA wie benötigt ≤ 250 ng
Phusion® DNA Polymerase 0,2 µl 0,02 U/µl
Reinstwasser bis 20 µl -
Tabelle 4: Temperaturprogramm des Thermocyclers einer PCR mit Phusion® High-Fidelity Polymerase
Reaktionsschritt Temperatur [°C] Dauer
Initiale Denaturierung 98 30 s
PCR-Amplifikation (35 Zyklen)
Denaturierung 98 10 s
Hybridisierung Primer-spezifisch 30 s
Elongation 72 15s /kbp
Finale Elongation 72 5 min
2.6.5 Gelelektrophorese
Um Gemische unterschiedlich großer DNA-Fragmente aufzutrennen wurde eine Gel-elektrophorese in einem 0,8 % Agarosegel durchgeführt. Kleine DNA-Fragmente durch-wandern das Gel in einem angelegten elektrischen Feld schneller als große DNA-Fragmente, was eine spezifische Auftrennung nach der Größe der Fragmente erlaubt.
Dieser Effekt ist auf die Siebeigenschaften des Agarosegels zurückzuführen, das kleine-ren Fragmenten einen geringekleine-ren Widerstand entgegensetzt als größekleine-ren. Durch das gleichzeitige Auftragen eines DNA-Größenstandards (100 bp DNA-ladder extended, Carl Roth, Karlsruhe) mit definierten Bandengrößen ließen sich die jeweiligen Längen der Fragmente abschätzen. Die Auftrennung erfolgte bei einer elektrischen Spannung von 80 V und einer Stromstärke von 150 mA. Dem Agarosegel zugesetztes Ethidiumbromid interkalierte in der doppelsträngigen DNA und ermöglichte die Sichtbarmachung der Banden unter UV-Licht und deren Dokumentation.
2.6.6 Genotypisierung von T-DNA Insertionsmutanten
Um die Position der T-DNA Insertion innerhalb des Genoms zu bestimmen wurde eine PCR mit zwei gen- und einem T-DNA spezifischen Primer durchgeführt (Ríos et al., 2002).
Die beiden genspezifischen Primer werden dabei so gewählt, dass sie die vermutete In-sertionsposition flankieren, der T-DNA spezifische Primer bindet im Außenbereich der T-DNA , zum Beispiel in der Left-Boarder. Im Falle einer T-DNA Insertion wird das PCR-Produkt aus T-DNA spezifischem und einem genspezifischen Primer ein Amplikon defi-nierter Größe ergeben, das allerdings von einem Amplikon, das ausschließlich durch die genspezifischen Primer ohne T-DNA Insertion gebildet wird, aufgrund der Größe zu un-terscheiden sein muss. In einem PCR-Ansatz, der alle drei Primer enthält, lassen sich folgende mögliche Kombinationen von zwei Allelen nachweisen: WILDTYP/WILDTYP, WILDTYP/mutante und mutante/mutante.
Abbildung 6: Funktionsprinzip der Genotypisierung von T-DNA Insertionsmutanten
A: Schematische Darstellung des WT Locus (oben) und des Locus mit der T-DNA Insertion (unten) sowie der Lage der Primer und der gebildeten Amplikons. LP: Linker genomischer Primer; RP: Rechter genomi-scher Primer; LB: T-DNA spezifigenomi-scher Primer im Bereich der Left Boarder. B: Schematische Darstellung der in einem Agarosegel aufgetrennten PCR-Produkte in den drei möglichen Allel-Kombinationen: Wild-typ (WT), Heterozygot (HT) und Homozygot (HM).
Verändert nach http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html.
2.6.7 Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Die Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion wurde mit Hilfe des Super-Script® One-Step RT-PCR with Platinum Taq Kits (Life Technologies, Darmstadt) gemäß Anweisung des Herstellers durchgeführt. Während der RT-PCR wird mRNA mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase und Oligo(dT)18 Primern in cDNA umgeschrieben, um mit einer nachfolgenden PCR anhand der Intensität der im Gel aufgetragenen Fragment-banden semiquantitative Aussagen über die Genexpression zu treffen.
A
B
Produkt 1
Produkt 2
Tabelle 5: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes einer RT-PCR mit SuperScript® One-Step RT-PCR with Platinum Taq
Reagenz Volumen Konzentration (final)
2 x Reaction Mix 25 µl 1 x
Forward Primer (50 µM) 1 µl 0,2 µM
Reverse Primer (50 µM) 1 µl 0,2 µM
Template RNA x µl 10 pg – 1 µg
RT / Platinum Taq Mix 1 µl -
Reinstwasser bis 50 µl -
Tabelle 6: Temperaturprogramm des Thermocyclers einer RT-PCR mit SuperScript® One-Step RT-PCR with Platinum Taq
Reaktionsschritt Temperatur [°C] Dauer
cDNA Synthese und Denaturierung
55 94
30 min 2 min PCR-Amplifikation
(30 Zyklen)
Denaturierung 94 15 s
Hybridisierung Primer-spezifisch 30 s
Elongation 72 1 min /kbp
Finale Elongation 72 5 min
2.6.8 cDNA Synthese
Als Vorbereitung einer Real-time quantitative Polymerase-Kettenreaktion wurde cDNA mit Hilfe des SuperScript® VILO cDNA Synthesis Kits (Life Technologies, Darmstadt) ge-mäß Anweisung des Herstellers aus RNA synthetisiert.
Tabelle 7: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes bei der cDNA Synthese mit dem SuperScript® VILO cDNA Synthesis Kit
Reagenz Volumen Konzentration (final)
5 x VILO Reaction Mix 25 µl 1 x
Template RNA x µl bis zu 2,5 µg
10x SuperScript Enzyme Mix 2 µl -
Reinstwasser bis 20 µl -
Tabelle 8: Temperaturprogramm des Thermocyclers bei der cDNA Synthese mit SuperScript® VILO cDNA Synthesis Kit
Reaktionsschritt Temperatur [°C] Dauer
Ribonuklease-Inhibition 25 10 min
cDNA Synthese 42 60 min
Enzym-Inaktivierung 85 5 min
2.6.9 Real-time quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RTQ-PCR) Die Real-time quantitative Polymerase-Kettenreaktion stellt eine technische Verfeine-rung der RT-PCR Methode dar. Dabei wird die Menge der amplifizierten DNA durch oreszenzmessung direkt quantitativ erfasst. Ein dem Reaktionsansatz zugegebener Flu-oreszenzfarbstoff interkaliert in doppelsträngiger DNA, wobei ein Anstieg des Fluores-zenzsignals, jeweils zum Ende eines Elongationszyklus, mit der Zunahme an amplifizier-ter DNA korreliert.
Die RTQ-PCR wurde mit Hilfe des Power SYBR® Green PCR Master Mix (Life Technolo-gies, Darmstadt) gemäß Anweisung des Herstellers in einem StepOne Real-Time PCR Sys-tem (Life Technologies, Darmstadt) durchgeführt.
Tabelle 9: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes einer RTQ-PCR mit dem Power SYBR® Green PCR Master Mix
Reagenz Volumen Konzentration (final)
Power SYBR® Green PCR Master Mix 10 µl 1 x
Forward Primer (50 µM) 0,1 µl 0,025 µM
Reverse Primer (50 µM) 0,1 µl 0,025 µM
cDNA Template x µl mind. 10 ng
Reinstwasser bis 20 µl -
Tabelle 10: Temperaturprogramm des Thermocyclers einer RTQ-PCR mit dem Power SYBR® Green PCR Master Mix
Reaktionsschritt Temperatur [°C] Dauer
Initiale Denaturierung 95 10 min
PCR-Amplifikation (40 Zyklen)
Denaturierung 95 15 s
Elongation 60 1 min
Schmelzkurve
Denaturierung 95 15 s
Elongation 60 1 min
Temperaturgradient 60 - 95 0,3 °C/min
Finale Denaturierung 95 15 s