Die Analyse der Zusammensetzung des Wurzelsuberins der silip-2 Mutanten ergab eine fast 40 % Erhöhung der Gesamtsuberinmenge im Vergleich zum Wildtyp. Die Erhöhung der Gesamtmenge war dabei nicht auf einzelne Substanzklassen oder Monomere spezifi-scher Kettenlängen zurückzuführen sondern konnte in fast allen Suberinbestandteilen beobachtet werden (vgl. 3.3).
SiLip-2 ist eine GDSL-Lipase, die als Bestandteil der Enzymgruppe der Esterasen der Superfamilie der α/β-Hydrolasen zugeordnet wird (Akoh et al., 2004; Ling, 2008;
Volokita et al., 2011). Für mehrere GDSL-Lipasen konnte eine Funktion im Zusammen-hang mit der Kutinsynthese nachgewiesen werden: In Solanum lycopersicum wurde für die GDSL-Lipase CD1 eine Funktion als Acyl-Transferase gezeigt, die am Aufbau des Ku-tin-Polyesters beteiligt ist. Mutanten mit einem Gendefekt weisen nur 5-10 % des Fruchtkutins des Wildtyps auf (Girard et al., 2012; Yeats et al., 2012). In Oryza sativa konnte das Gen WDL1 (Wilted Dwarf and Lethal 1) identifiziert werden, das ebenfalls für ein Mitglied der GDSL-Lipase Familie kodiert. Der Gen-Knockout führte zu Veränderun-gen in der Struktur der Kutikula und der Zellwände, weshalb eine Funktion während der Organisation des Kutins postuliert wird (Park et al., 2010).
Die Überexpression der natürlicherweise nur in Pollen vorkommenden GDSL-Lipase/Esterase CDEF1 in A. thaliana führte zu massiven Defekten der Kutikula, weshalb eine Funktion als Cutinase angenommen wird (Takahashi et al., 2010). In weiteren Ex-perimenten konnte nachgewiesen werden, dass CDEF1 auch Suberin abbauen kann. So ließ sich in Wurzeln nach Expression von CDEF1 unter der Kontrolle eines Endodermis-spezifischen Promoters durch Färbung keine Suberinisierung nachweisen (Naseer et al., 2012).
Auf Grund ihrer Sequenz können Eigenschaften von Proteinen mit Hilfe der öffentlichen bioinformatischen Datenbank UniProt (UniProt Consortium, 2013) vorhergesagt wer-den. Für SiLip-2 wurde eine Hydrolase-Aktivität für Ester-Bindungen bestimmt. Des Weiteren wurde die subzelluläre Lokalisation des Proteins außerhalb der Zelle angege-ben. Auf Basis dieser Vorhersagen lässt sich über die Funktion von SiLip-2 in der Sube-rinbiosynthese spekulieren:
Die Beobachtung, dass die Suberinzusammensetzung in Wurzeln der silip-2 Mutante verändert ist, unterstützt die postulierte Beteiligung von SiLip-2 an der Synthese und Auflagerung von Suberin. Auf Grund der zuvor genannten Vorhersagen ist eine
Beteili-gung als Esterase denkbar, deren mögliches Substrat auf der Zellwand aufgelagertes Suberin ist. Dafür sprechen die vorhergesagte extrazelluläre Lokalisation und die zuvor beschriebene Funktion der verwandten GDSL-Lipase/Esterase CDEF1, deren Lokalisati-on ebenfalls im extrazellulären Bereich identifiziert wurde. SiLip-2 könnte die FunktiLokalisati-on übernehmen, einzelne Monomere oder Teile des Polyesters durch Hydrolyse der Ester-bindung abzuspalten. Im Falle eines Gen-Knockouts würde diese Abspaltung von Mo-nomeren nicht stattfinden, was in einer Erhöhung der Menge des gemessenen Ge-samtsuberins resultieren würde, wie in dem vorgestellten Ergebnis gemessen. Diese hypothetische Funktion ist nachfolgend in Abbildung 62 veranschaulicht.
Abbildung 62: Modell der Funktion von SiLip-2
Die Esterase SiLip-2 spaltet Monomere oder Teile des Polyesters durch Hydrolyse der Esterbindung ab und reduziert damit die Gesamtsuberinmenge (A). Im Falle eines Gen-Knockouts wird diese Funktion nicht mehr erfüllt, weshalb im Vergleich das gemessene Gesamtsuberin erhöht ist (B). PM: Plasmamemb-ran, Sub: Suberinauflagerung, ZW: Zellwand
Um die hier diskutierte Funktion überprüfen zu können, sind weitere Experimente not-wendig. Die vorgeschlagene Esterase-Aktivität ließe sich mit Hilfe eines kommerziell verfügbaren spektrophometrischen Esterase-Assays mit p-Nitrophenyl-Butyrat (Quinn et al., 1982) oder p-Nitrophenyl-Palmitat (Gupta et al., 2002) als Substrat nachweisen.
Die Lokalisation des Proteins ließe sich durch Fusion mit GFP und anschließende Be-obachtung der Fluoreszenzsignals überprüfen, wie auch für CDEF1 durchgeführt. Die Hypothese, dass SiLip-2 eine potentielle Suberin abbauende Funktion besitzt, könnte durch Generierung transgener SiLip-2 überexprimierender Pflanzen gezeigt werden.
Mögliche Unterschiede in der Menge des Gesamtsuberins könnten durch histochemische und gaschromatographische Analyse nachgewiesen werden. Eine mögliche Auswirkung auf Kutin könnte ebenfalls untersucht werden, da für CDEF1 sowohl Suberin als auch Kutin als mögliche Substrate gezeigt wurden. Auf Grund der Expressionsdaten, die auf eine Wurzel spezifische Expression hindeuten, scheint dies aber eher unwahrscheinlich.
Des weiteren wäre eine Betrachtung der suberinisierten Gewebe von silip-2 Mutanten und SiLip-2 überexprimierenden Pflanzen im Transmissionselektronenmikroskop denkbar, um mögliche Auswirkungen auf die Struktur suberinisierter Gewebe oder die Zellwandintegrität beobachten zu können.
Es bleibt abschließend zu diskutieren, warum der Knockout des SiLip-2 Gens zu verbes-serter Trockentoleranz führt. Nach zehn Tagen Austrocknung wirken Pflanzen des Ge-notyps silip-2 im direkten Vergleich zu WT-Pflanzen deutlich vitaler und weniger stress-anfällig (vgl. 3.3.1). Diese Beobachtung wird zusätzlich dadurch gestützt, dass sie in ih-rem Phänotyp Pflanzen des Genotyps esb1-2 gleichen, die sich durch eine verbesserte Toleranz gegenüber Trockenstress auszeichnen (Baxter et al., 2009). Die Autoren führ-ten diese verbesserte Toleranz auf die Erhöhung des Gesamtgehalts an Wurzelsuberin in der Mutante zurück. In Anbetracht der Tatsache, dass in silip2-Mutanten ebenfalls eine signifikant höhere Menge an Wurzelsuberin gemessen wurde, liegt die Vermutung nahe, dass die beobachtete verbesserte Toleranz gegenüber Trockenstress auf die gemessene erhöhte Suberinmenge zurückzuführen ist. Gemäß der Modellvorstellung sollte Suberin als Barriere den Wasserfluss durch den Wurzelappoplasten einschränken. Durch die erhöhte Suberinmenge wird sowohl der Wasserfluss zur Sprossachse als auch zurück in den Boden eingeschränkt.
Kritisch kann allerdings bemerkt werden, dass die verbesserte Trockentoleranz mög-licherweise durchaus auch mit einer Verminderung der stomatalen Transpirationsraten in Verbindung stehen könnte. Um diesen Effekt ausschließen zu können, sollten ent-sprechende Messungen durchgeführt werden, wie sie zum Beispiel von Baxter et al (2009) beschrieben wurden.
Da Veränderungen der silip-2 Suberinmonomere nicht in allen Substanzklassen beo-bachtet wurden, wie es in der esb1 Mutante der Fall ist, lassen sich des weiteren aber auch mögliche strukturelle Veränderungen des Suberins und daraus resultierende Aus-wirkungen auf die Barriereeigenschaften spekulieren. Besonders betroffen von den Ver-änderungen des silip2 Suberins sind ω-Hydroxysäuren und Dicarbonsäuren, denen eine besondere Bedeutung bei der Quervernetzung des Suberinpolymers zukommt. Es wäre daher möglich zu spekulieren, dass es zu einer dichteren Verknüpfung des Suberinpo-lymers kommen könnte, die zu einer Einschränkung der Wasserdurchlässigkeit führt.
Zusammenfassend ist es verlockend zu formulieren, dass die vorgestellte These, dass es durch den Knockout der putativen Esterase SiLip2 zu einer Erhöhung der messbaren Suberinmenge kommt, die zu einer verbesserten Trockentoleranz führt, durchaus in das
beschriebene Suberinmodell passt, weitere Untersuchungen jedoch notwendig sind. So bleibt die Identifizierung eines weiteren Mutantenallels oder die Komplementierung der silip2 Mutante und die chemische Analyse des Wurzelsuberins für eine tiefergehende Betrachtung neben den bereits zuvor beschriebenen Experimenten unerlässlich, um die Funktionsweise des Gens SiLip2 aufzuklären.