MBP-NLP1CRM1
5.1. Molekularbiologische Methoden
5. METHODEN
5.1. Molekularbiologische Methoden
5.1.1. Transformation chemisch kompetenter Bakterien
Die chemisch‐kompetenten gemachte Bakterien werden auf Eis aufgetaut und dann für 30 Minuten auf Eis mit der zu transformierenden DNA inkubiert. Nach einem Hitzeschock für 90 Sekunden bei 42°C und anschließendem Runterkühlen der Bakterien auf Eis für 2 Minuten, wird 400 µl SOC‐Medium zu den Zellen gegeben.
Nach einer Inkubation von einer Stunde bei 37°C im Bakterienschüttler können die Zellen auf LB‐Agarplatten inkubiert werden.
5.1.2. Plasmid‐Aufreinigung (Minipräparation)
Geringe Plasmid‐DNA‐Mengen werden durch alkalische Lyse (Birnboim et al., 1979 [145]) und nachfolgende Präzipitation isoliert. Hierzu wird eine 2 ml Übernachtkultur abzentrifugiert (1000 g, 1 min) und in 200 µl Puffer P1 resuspendiert. Die Lyse erfolgt durch Zugabe von 200 µl Lysierungspuffer P2 und nachfolgendes Invertieren für 5 min bei Raumtemperatur. Chromosomale DNA und Proteine werden danach durch Zugabe von 200 µl Neutralisationspuffer P3 für 5 min auf Eis gefällt. Durch Zentrifugation (13,000 g, 30 min) findet eine Trennung der löslichen Plasmide von den unlöslichen Komponenten (Chromosomale DNA und Proteine) statt. Zur Fällung der Plasmide wird 600 µl des Überstandes mit 1 ml eiskaltem 100% Ethanol gemischt und die Plasmide 15 min bei 13000 g abzentrifugiert. Nach einem Waschschritt mit 70% (v/v) Ethanol wird das Plasmidpellet getrocknet und in 50 µl TE‐Puffer aufgenommen.
Größere Plasmidmengen wurden mit Hilfe des NucleoBond®PC100 oder PC500 von Macherey&Nagel gereinigt.
5.1.3. DNA‐Konzentrationsmessung
Die DNA‐Konzentration wurde bei OD260 photometrisch gemessen. Das Verhältnis
OD260 zu OD280 liefert dabei Informationen über die Reinheit der DNA. Der Quotient
sollte zwischen 1,8 und 2 liegen.
5.1.4. Agarosegelelektrophorese
Um Plasmide oder DNA‐Fragmente ihrer Größe nach aufzutrennen, wird die DNA mit 10x DNA‐Probenpuffer versetzt und auf das mit Ethidiumbromid (5 µg/ml) versetzte Agarosegel aufgetragen. In dieser Arbeit wurden je nach Größe des DNA‐
Fragments 0.5‐2 % Agarosegele verwendet. Die Auftrennung der DNA‐Fragmente erfolgt durch Anlegung einer Spannung von 80‐140 V. Die Analyse erfolgt mit Hilfe von UV‐Licht (Wellenlänge 365 nm).
5.1.5. Isolation von DNA aus Agarosegel
Nachdem die DNA‐Fragmente durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt sind, können die DNA‐Banden ausgeschnitten und die DNA mit Hilfe des NucleoSpin®Extract II‐Kits von Macherey&Nagel gereinigt werden.
5.1.6. DNA‐Verdauung durch Endonucleasen
Mit Hilfe von Restriktionsendonucleasen können Phosphodiesterbindungen der DNA hydrolytisch gespalten werden. Dabei erkennt das Enzym spezifische, palindromische Sequenzen, die für jedes Enzym unterschiedlich sind.
Zum Schneiden von PCR‐Produkten und Plasmid‐DNA werden je nach Herstellerangaben 1‐8 U Enzym pro 1 µg DNA eingesetzt und der angegebene Puffer
verwendet. Die Reaktion erfolgt, wenn nicht anders angegeben, bei 37°C für 1‐3 Stunden.
5.1.7. Ligation
Mit Hilfe von DNA‐Ligasen können 3’‐Hydroxylgruppen und 5’‐Phosphatgruppen von DNA‐Strängen zu einer Phosphodiesterbindung verbunden werden.
In einem Reaktionsvolumen von 10 µl werden 1 U T4‐Ligase (Fermentas), Ligationspuffer (Fermentas), Insert und Vektor gemischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Verhältnis von Insert zu Vektor liegt hierbei bei 1:3‐
1:6. Nach der Ligation wird die Hälfte des Ligationsansatzes in kompetente DH5α transformiert.
5.1.8. Sequenzierung von Plasmiden
Alle Plasmide, die durch PCR erstellt wurden, wurden mit Hilfe der Ketten‐Abbruch‐
Reaktion nach Sanger et al 1977 [146] sequenziert. Die Reaktionen werden mit Hilfe des BigDye Terminator v1.1 cycle sequencing kit von Applied Biosystems durchgeführt. Hierzu werden ca. 200 ng Plasmid‐DNA, 10 pmol Primer, 2 µl Sequenzierungspuffer und 1 µl Sequenzierungsmix gemischt und mit H2O auf 10 µl aufgefüllt. Das PCR‐Programm ist unten aufgeführt.
Anschließend muss der PCR‐Ansatz gereinigt werden. Dazu wird dem PCR‐Ansatz 1 µl 125 mM EDTA, 1 µl 3 M Na‐Acetat pH 5.2 und 50 µl 100% Ethanol hinzugefügt und für 20 min bei 13.000 g zentrifugiert. Das Pellet kann dann mit 70% (v/v) Ethanol gewaschen werden. Nach Trocknen der DNA wird diese in 30 µl H2O aufgenommen. Die Sequenzierung erfolgt mittels „Genetic Analyser 3100“ der Firma Applied Biosystems im Göttinger Zentrum für Molekulare Biowissenschaften (GZMB).
Vorgang Temperatur Dauer
Primäre DNA‐Denaturierung 96°C 2 min
Denaturierung 96°C 10 s
Primer‐Annealing 55°C 15 s
Elongation 60°C 4 min
5.1.9. Polymerase‐Kettenreaktion (PCR)
Durch das Prinzip der Polymerase‐Kettenreaktion, das auf K.B. Mullis et al , 1990 [147] zurückzuführen ist, ist eine Amplifikation spezifischer DNA‐Fragmente möglich. Hierzu sind zwei Primer notwendig, die den Anfang und das Ende des Amplikons definieren.
Das Reaktionsvolumen einer typischen PCR beträgt 50 µl und enthält 50‐500 ng DNA‐Template oder 1‐2 µl cDNA, jeweils 20 pmol des Vorwärts‐ und Rückwärts‐
Primers, 200 µM dNTPs und 1‐2 U Polymerase ( Vent, Phusion, oder PAN ScriptDNA Polymerase). Annealing‐Temperaturen wurden mit Hilfe von Online‐Kalkulatoren berechnet (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html beim Gebrauch von Vent und PAN ScriptDNA Polymerase und https://www.finnzymes.fi/tm_determination.html bei der Phusion‐Polymerase). Die Amplifikationszeit hängt von der Prozessivität der jeweiligen Polymerase ab (PAN ScriptDNA Polymerase und Vent 500 bp/min, Phusion 1 kb/15‐30s). Ein typisches PCR‐Programm ist unten dargestellt.
Vorgang Temperatur Dauer
Primäre DNA‐Denaturierung 96°C 2 min
Denaturierung 96°C 10 s
Primer‐Annealing 45‐70°C 15‐30 s
Elongation 72°C an Polymerase
angepasst
35 Zyklen
Abschluss‐Elongation 72°C 10 min
Kühlung 4°C ∞
5.1.10. Gerichtete in vitro Mutagenese
Zur Herstellung des MBP‐NLP1 165Δ204‐Konstrukts wurden revers‐komplementäre Primer konstruiert, die den zu deletierenden Bereich umfassen. Als Matritze dient das Plasmid, in das die Mutation eingefügt werden soll.
Der Reaktionsansatz enthält 5 pmol jeden Primers, 5 nmol dNTPs, 10 µl 5xPhusion‐
Puffer, 200 ng DNA und 0.5 µl Phusion. Nachdem das PCR‐Programm (siehe Tabelle unten) beendet ist, wird dem PCR‐Ansatz DPN1 hinzugefügt, was zum Verdau der methylierten bakteriellen DNA führt. Nach dem DPN1‐Verdau bei 37°C kann die DNA in kompetente Bakterien transformiert werden.
Zur Herstellung aller FG‐Repeat‐Mutationen wurde strikt nach dem Protokoll des QuickChange Site‐Directed Mutagenesis Kits von Stratagene vorgegangen. Die Primer für diese Mutationen wurden ebenfalls so konstruiert, dass sie den Bereich umfassen, in dem der Basenaustausch stattfinden soll, sowie die neueingefügten anstelle der auszutauschenden Basen.
Vorgang Temperatur Dauer
Primäre DNA‐Denaturierung 98°C 30 min
Denaturierung 98°C 15 s
Primer‐Annealing 55°C 30 s
Elongation 72°C 3 min
30 Zyklen
Abschluss‐Elongation 72°C 12 min
5.2. Biochemische Methoden
5.2.1. Trennung von Proteinen mittels SDS‐Polyacrylamid‐Gelelektrophorese (SDS‐
PAGE)
Die Trennung von Proteinen erfolgte nach der von Laemmli et al., 1970 [148]
beschrieben Methode. Proteinproben werden mit Proteinprobenpuffer versetzt, für 5 min bei 95°C aufgekocht, um dann bei 25 mA der Größe nach im elektrischen Feld