Die Rolle von NLP1 im poly(A)mRNA‐Export

Verschiedene Untersuchungen zeigten, dass NLP1 mit Faktoren, die im RNA‐Export  beteiligt sind (TAP, Gle1), interagiert (Katahira et al., 1999 [103]; Wiegand et al.,  2002  [113];  Kendirgi  et  al.,  [98]  2005).  Interessanterweise  konnte  in  Kompetitionsstudien dieser Arbeit gezeigt werden, dass der mRNA‐Exportfaktor  TAP und  der  Proteinexportkomplex  bestehend  aus CRM1,  RanGTP  und  einem  Exportsubstrat, gleichzeitig an NLP1 binden können, ohne um die Bindung an NLP1  zu konkurrieren (Abschnitt 2.3.8.). Da NLP1 eine essentielle Aufgabe im Export der  mRNA  von  HSP  70  unter  Hitzeschockbedingungen  (42°C)  zugesprochen  wurde  (Kendirgi et al., [98]), dessen Rolle im generellen Export von mRNA aber noch unklar  war, wurde diese im Abschnitt 2.4.1. dieser Arbeit in NLP1‐Überexpressions‐ oder ‐ Depletions‐Studien genauer analysiert. Es stellte sich heraus, dass die Depletion von  NLP1 mittels siRNA keinen Effekt auf die Lokalisation von poly(A)mRNA hatte. Da  die Depletionseffizienz von NLP1 auf Proteinebene im besten Fall ca. 90% betrug,  muss  hier  auch  in  Betracht  gezogen  werden,  dass  die  übriggebliebenen  10% 

ausreichend für die Ausführung eventueller Funktionen im mRNA‐Export waren.  

Starke Überexpression von NLP1 führte zur  Inhibition des mRNA‐Exports. Eine  Vermutung ist, dass durch die große Anzahl an überexprimierten NLP1‐Molekülen  wichtige Faktoren für mRNA‐Export (zum Beispiel TAP oder Gle1) im Kern gebunden  werden, welche daraufhin nicht mehr für den mRNA‐Export zur Verfügung stehen  und es somit zur Inhibition des Exports kommt.  

Wie bereits erwähnt, zeigten frühere Untersuchungen, dass NLP1 notwendig für  den Export der mRNA des Hitzeschockproteins HSP 70 ist (Kendirgi et al., 2005 [98]). 

Auf  Grund  dessen,  dass  keine tragende Rolle  für  NLP1  im  Export  von mRNA  festgestellt werden konnte, liegt die Vermutung nahe, dass NLP1 entweder nur für  den  Export  spezifischer  mRNAs  essentiell  ist  oder  nur  unter  bestimmten  Bedingungen,  wie  zum  Beispiel  unter  Hitzestress,  wie  es  bei  Kendirgis  Untersuchungen der Fall war, für  den  mRNA‐Export notwendig  wird. Letzteres  scheint für das NLP1 Homolog aus Hefe, Rip1p/Nup42, zuzutreffen. Untersuchungen  zeigten  hier,  dass  in  Rip1p/Nup42‐depletierten  Hefezellen,  der  Export  von 

poly(A)mRNA bei 42°C, nicht aber bei 25°C stark inhibiert ist (Vainberg et al., 2000  [102]). 

Da die Depletion von NLP1 keinen und nur sehr starke Überexpression von NLP1  einen Effekt auf die poly(A)mRNA Lokalisation zeigte, kann davon ausgegangen  werden,  dass  NLP1  unter  „Normalbedingungen“  keine  tragende  Rolle  beim  generellen Export von mRNAs hat. Der Fokus dieser Arbeit wurde daher auf die  Erforschung der Rolle von NLP1 im Proteinexport gerichtet. 

3.4. Biochemische Charakterisierung von NLP1   

Verschiedene Bindungsstudien dieser Arbeit zeigten, dass NLP1 sowohl im Komplex  mit RanGTP und CRM1 als auch im Komplex mit CRM1, RanGTP und einem NES‐

Substrat vorliegen kann. Dabei ist eindeutig, dass die zusätzliche Bindung eines NES‐

Substrates die Affinität von NLP1, CRM1 und RanGTP zueinander erhöht und dass  die Zugabe von NLP1 die Affinität von CRM1 zu RanGTP und zum NES‐Substrat  verstärkt (Abschnitt 2.3.1.).  

Interessanterweise  war  nicht  nicht  der  FG‐repeat‐reiche  C‐Terminus  von  NLP1  sondern die nur 2 FG‐repeats beinhaltende N‐terminale Hälfte für die Interaktion  mit CRM1 verantwortlich (Abb. 2.8.). In verschiedenen Hefe‐zwei‐Hybridanalysen  wurde entgegen diesem Resultat postuliert, dass der C‐Terminus von NLP1 mit  CRM1  interagiert  (Strahm  et  al.,  1999  [97];  Rouzic  et  al.,  2002  [137]).  Diese  Diskrepanz kann einerseits daher zustande kommen, dass unsere Versuche mit  rekombinanten Proteinen aus Bakterien durchgeführt wurden und ihnen deshalb  zum Beispiel spezifische, für Interaktion mit CRM1 notwendige Modifikationen wie  O‐Glykosylierungen oder Phosphorylierungen usw. fehlten. Andererseits fanden die  vorher  beschriebenen  Interaktionstudien  in  einem  Zellsystem  (Saccharomyces  Cervisiae)  statt, das neben den  zu  untersuchenden Proteinen den  kompletten  Proteinsatz einer Zelle enthält. Folglich kann eine indirekte Interaktion dort nicht  ausgeschlossen werden.  

Da NLP1 als O‐glykosyliert beschrieben wurde (Farjot et al., 1999 [96]), sollte der  Einfluss  der  Glykosylierung  auf  das  Bindeverhalten  von  NLP1  überprüft  und  rekombinantes NLP1 in vitro O‐glykosyliert werden. Obwohl die Positivkontrolle  p62, eins der am besten charakterisierten O‐glykosylierten Nukeoporine (Holt et al.,  1987  [138]),  eine  deutliche  Glykosylierung  zeigte,  konnte  bei  NLP1  keine  Glykosylierung  unter den  hier gewählten Bedingungen  festgestellt werden. Ein  essentieller Unterschied zu dem Experiment von Farjot et al. ist, dass bei unserem  Ansatz  rekombinante  Proteine  aus  Bakterien  verwendet  wurden,  während  ihr  Ansatz in vitro‐translatiertes NLP1 aus Retikulozytenlysat enthielt. Es könnte daher  sein, dass dem rekombinanten NLP1 aus Bakterien Modifikationen fehlten, die zur  Glykosylierung benötigt werden oder dass die Bakterien, aus denen NLP1 isoliert  wurde, das Protein so modifiziert haben, dass eine Glykosylierung ausgeschlossen  ist. Um die  generelle Glykosylierung von  endogenem NLP1 aus HeLa‐Zellen zu  überprüfen,  sollte  aus  einem  HeLa‐Zelllysat  endogenes  NLP1  mittels  WGA‐

Sepharose präzipitiert werden. Allerdings konnte endogenes NLP1 ebenfalls nicht  mit WGA‐Sepharose präzipitiert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen also  eher vermuten, dass NLP1 nicht glykosyliert in der Zelle vorliegt. 

Zusammenfassend  kann  gesagt  werden,  dass  NLP1  trimere  und  tetramere  Komplexe mit CRM1 und RanGTP in An‐ oder Abwesenheit eines NES‐Substrates  eingehen kann. Interessanterweise ist für diese Komplexbildung nicht wie erwartet  der C‐Terminus, der die meisten FG‐Repeats enthält, sondern eher die N‐terminale  Hälfte von NLP1 notwendig, die nur zwei FG‐Repeats beinhaltet. Da strukturelle  Untersuchungen des Transportfaktors Importin β mit unterschiedlichen FG‐Repeat‐

Peptiden  gezeigt  haben,  dass  die  Bindung  von  Nucleoporinen  und  Transportrezeptoren durch Interaktion der FG‐Repeats mit hydrophoben Bereichen  zwischen den HEAT‐Repeats der Transportrezeptoren zustande kommt (Bayliss et  al., 2000 und 2002 [63, 69]), wäre es sehr aufschlussreich die Interaktion zwischen  CRM1 und einer FG‐Repeat‐defizienten Mutante des NLP1‐N‐Terminus näher zu  untersuchen.  

3.5. NLP1 fördert den Export verschiedener Exportsubstrate   

Die Überexpression von NLP1 führte bei verschiedenen Substraten (NES‐GFP2‐cNLS  und  NC2ß‐GFP2) in FLIP‐ und konventionellen mikroskopischen Analysen dieser  Arbeit zu einem erhöhten Export aus dem Zellkern. Die Depletion von NLP1 führte  hingegen zu etwas vermindertem, aber dennoch funktionierendem Export. Dies  lässt darauf schließen, dass NLP1 als ein Co‐Faktor für den CRM1‐abhängigen Export  fungiert, welcher zwar den Export verschiedener Substrate fördern kann, für diesen  aber nicht essentiell ist. Eine Möglichkeit ist, dass NLP1 den Export von Proteinen,  die eine geringe Affinität zu CRM1 haben, fördert. Solche Proteine stehen mit für  CRM1 hochaffinen Exportsubstraten in Konkurrenz, was ein Grund dafür ist, dass für  niedrigaffine Exportsubstrate die CRM1‐Konzentration in der Zelle limitierend ist  (siehe Abschnitt 2.1.). Sowohl für das einfache Reporterprotein NES‐GFP2‐cNLS als  auch für NC2ß‐GFP2 ließ sich dieser Sachverhalt bestätigen, denn der Effekt nach  Überexpression von  NLP1 war  ähnlich  dem Effekt  nach CRM1‐Überexpression: 

beide Proteine wurden effizienter aus dem Zellkern exportiert. Wie aber kommt  dieser Effekt zustande? Die Bindungsstudien dieser Arbeit lassen vermuten, dass ein  Grund für die erhöhte Exportrate die erhöhte Bindungsaffinität von CRM1, Substrat  und RanGTP sein könnte. Die Ergebnisse in Kapitel 2.3.1. zeigten eindeutig, dass  NLP1 die Interaktion zwischen CRM1 und RanGTP fördert und zusätzlich die Affinität  von CRM1 zum Export‐Substrat erhöht. Die Vermutung, dass NLP1 den Export von  speziell niedrigaffinen Substraten fördert, setzt allerdings voraus, dass niedrigaffine  Exportsubstrate  gegenüber  hochaffinen  Exportsubstraten  in  den  tetrameren  Komplexen (bestehend aus NLP1, CRM1, RanGTP und Exportsubstrat) bevorzugt  werden (Abb.  3.1.A).  Tatsächlich gibt  es einen Co‐Faktor im CRM1‐abhängigen  Export,  der  genau  dieses  Verhalten  zeigt:  RanBP3  fördert  die  Bindung  vom  schwächeren NES‐Substrat (BSA‐NES) an CRM1, auch wenn ebenfalls ein Substrat  mit höherer Affinität (Snurportin1) für CRM1 vorhanden ist (Engelmeier et al., 2001  [45]). Computergestützte Strukturanalysen von einem CRM1‐RanGTP‐Snurportin1‐

RanBP3‐Komplex haben gezeigt, dass die Bindung von RanBP3 an CRM1 eine der  drei Bindungen von Snurportin1 an CRM1, sterisch, in einem Bereich der ungefähr  30 Å von der hydrophoben NES‐Bindungsgrube entfernt ist, schwächt (Langer et al.,