7.3 Expression der E2-Proteine mit Hilfe des viralen Vektors BRSV
7.3.5 Eignung von BRSV-E2, BRSV-E2-G(MT), BRSV-E2-G(MT)Y/A und
Sowohl für BVD/MD als auch für die durch BRSV hervorgerufenen Atem-wegserkrankungen stehen Lebend- und Totimpfstoffe zur Verfügung. Trotzdem ist ein Bedarf an sicheren, effektiven und kostengünstigen Vakzinen vorhanden, da diese beiden Errankungen große wirtschaftliche Verluste in der Rinderhaltung verursachen. Das BVD-Virus soll in Deutschland langfristig ausgemerzt werden, so dass effektive Impfstoffe zur Reduktion der BVDV-Infektionen unbedingt erforderlich sind.
Bei einem Impfstoff gegen BVD/MD ist besonders die Problematik der transplazentaren Übertragung des Virus zu beachten. Die ideale Vakzine würde sicher vor Ausbildung klinischer Symptome beim immunkompetenten Tier schützen und eine transplazentare Übertragung von BVDV vom geimpften Muttertier auf das ungeborene Kalb verhindern. Des weiteren dürfte es durch Impfung trächtiger Tiere nicht zur transplazentaren Übertragung des Impfvirus auf das ungeborene Kalb kommen und bei persistent infizierten Tieren dürfte durch eine unbeabsichtigte Impfung keine MD ausgelöst werden. Damit eine Unterscheidung zwischen Feld- und Impfvirus möglich ist, sollte die Vakzine zusätzlich einen Marker tragen, der dieses ermöglicht. Sowohl die Lebend- als auch die Totimpfstoffe erfüllen nur einen Teil dieser Bedingungen. Markervakzinen für BVDV und BRSV sind bislang nicht auf dem Markt.
Da bei BRSV-E2, BRSV-E2-G(MT), BRSV-E2-G(MT)Y/A und BRSV-E2(MTdel) nur das Hauptimmunogen E2, bzw. E2-G(MT), E2-G(MT)Y/A oder E2(MTdel) für die Vakzination genutzt werden würde, kann es bei einer solchen Impfung nicht zu einer transplazentaren Übertragung des Impfvirus kommen. Somit kann eine Impfung trächtiger Tiere mit diesen Viren nicht zur Ausbildung persistent infizierter Kälber führen. Auch die Induktion der MD durch unbeabsichtigtes Impfen persistent infizierter Kälber wäre mit einem solchen Impfstoff ausgeschlossen.
Ob diese Impfviren sicher vor den klinischen Symptomen und einer transplazentaren Übertragung bei einer BVDV-Infektion schützen, muß jedoch erst im Tierexperiment untersucht werden. Dabei wird es interessant sein, ob E2, E2-G(MT), E2-G(MT)Y/A oder E2(MTdel) Unterschiede in ihrer Immunogenität aufweisen, die durch die unterschiedliche Lokalisation der Proteine hervorgerufen wird.
Grundsätzlich ist ein Schutz vor einer BVDV-Infektion durch ausschließliche Verabreichung oder Expression des E2-Proteins möglich. Dazu wurde E2-Protein nach der Expression mit unterschiedlichen Vektoren gereinigt und den Tieren appliziert (HULST et al., 1993; BOLIN u. RIDPATH, 1996) oder E2 wurde durch Applikation von Plasmid- oder Virusvektoren im Tier exprimiert (HARPIN et al., 1997, 1999; ELAHI et al., 1999a, b; KWEON et al., 1999; GRIGERA et al., 2000; NOBIRON et al., 2001, 2003; YU et al., 2001). Bei diesen Immunisierungsstudien wurden häufig Mäuse verwendet, ein Teil der Studien wurde jedoch auch mit Rindern (BOLIN u.
RIDPATH, 1996; KWEON et al., 1999) bzw. Schweinen (HULST et al., 1993; YU et al., 2001) durchgeführt. Die vakzinierten Tiere bildeten Antikörper gegen das E2-Protein und waren, wenn die Tiere anschließend mit BVDV infiziert wurden, vor einer Infektion geschützt.
Ein weiterer Vorteil für die Immunantwort gegen das E2-Protein bei Vakzination mit den E2-tragenden BRS-Viren ist die Stimulation der humoralen und zellulären Immunantwort durch Verabreichung von vermehrungsfähigen Viren. Dies wird wahrscheinlich zu einer verstärkten Immunantwort gegen das E2-Protein führen.
Bei natürlichen BRSV-Infektionen kommt es immer wieder zu Reinfektionen, da keine belastbare Immunität ausgebildet wird (MURPHY, 1999). Bei Vakzination gegen BRSV-bedingte Atemwegserkrankungen ist es grundsätzlich schwierig, eine belastbare Immunität zu induzieren. Vorteilhaft wäre bei der Vakzination eine
intranasale Applikation des Impfstoffs, da die Schleimhautimmunität dem Tier den größtmöglichen Schutz gegenüber Reinfektionen bietet (KIMMAN u.
WESTENBRINK, 1990). Beim Stamm BRSV ATue51908 handelt es sich um einen attenuierten Laborstamm. Ob mit diesem BRSV-Stamm eine belastbare Immunität hervorgerufen werden kann, muß im Tierexperiment untersucht werden. Sollte dieser BRSV-Stamm nicht ausreichend immunogen wirken, so wäre die Verwendung anderer Stämme, eventuell etablierter Impfstämme, in Erwägung zu ziehen.
Ein weiteres Problem stellt die Booster-Impfung mit viralen Vektoren dar. Da bei der Erstimmunisierung die Immunantwort nicht nur gegen das Fremdprotein, sondern auch gegen den Vektor selbst gerichtet ist, ist eine Booster-Impfung mit dem gleichen Vektor meist nicht sehr effektiv. Ob diese Ineffektivität auch für BRSV als Vektor zutrifft ist fraglich, da auch unter natürlichen Bedingungen Reinfektionen vorkommen. Eine mögliche Abhilfe für dieses Problem würde ein Austausch des F-und G-Proteins gegen die entsprechenden Proteine eines antigenetisch möglichst weit entfernten Stammes darstellen, so dass es bei der Booster-Impfung nicht zur Neutralisation des Vektors kommt. Ein solcher Austausch der immunogenen Proteine eines viralen Vektors wurde schon erfolgreich bei VSV praktiziert (ROSE et al., 2000).
Das rekombinante BRSV-System mit der integrierten Klonierungskassette bietet jedoch noch weitere Vorteile: so könnten z. B problemlos spezielle Markerproteine oder –peptide mit diesem Vektor exprimiert werden, über die eine spätere Selektion zwischen Feld- und Impfvirus möglich wäre. Eine Selektion wäre auch über den immunologischen Nachweis von Erns bzw. NS3 möglich, die nach einer Impfung nicht detektierbar wären, jedoch nach einer Feldinfektion nachgewiesen werden könnten.
Auf diese Weise könnten die E2-tragenden BRS-Viren zusätzlich als Markervakzinen genutzt werden.
8 Zusammenfassung
Wiebke Köhl
Expression des E2-Glycoproteins des Virus der bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) mit Hilfe von Plasmid- und Virusvektoren
Das Virus der bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) ist dem Genus Pestivirus innerhalb der Familie Flaviviridae zugeordnet. Infektionen von immunkompetenten Rindern mit dem BVD-Virus verlaufen meist nur mit milden klinischen Symptomen oder sind symptomlos. Jedoch können transplazentare Übertragungen von BVDV zu Aborten, Fruchtbarkeitsstörungen, Missbildungen oder zur Geburt persistent infizierter Kälber führen, die nach 6 bis 24 Monaten an der Mucosal Disease sterben. Das bovine respiratorische Synzytialvirus (BRSV) gehört innerhalb der Familie Paramyxoviridae zu dem Genus Pneumovirus und ist der wichtigste virale Infektionserreger akuter Atemwegserkrankungen bei Kälbern im Alter von 4 Wochen bis 6 Monaten.
Hauptziel einer protektiven Immunantwort bei einer BVDV-Infektion ist das E2-Protein. Dieses Protein wird in infizierten Zellen im Endoplasmatischen Retikulum (ER) zurückgehalten.
Wir haben verschiedene chimäre, trunkierte und mutierte Formen des E2-Proteins erstellt und die Expression, den Transport und die Lokalisation dieser Proteine untersucht. Bei den chimären E2-Proteinen wurde der Membrananker und/oder der cytoplasmatische Abschnitt gegen die entprechenden Regionen des BRSV-F- oder des G-Proteins des Virus der vesikulären Stomatitis (VSV) ausgetauscht. Die trunkierten E2-Proteine wiesen Deletionen in ihrem Membrananker und/oder cytoplasmatischen Abschnitt auf. Zusätzlich wurden E2-Proteine mit einer Punktmutation in der Mitte des Membranankers erstellt, bei denen Arginin gegen Alanin ausgetauscht wurde. Für die Expression wurden drei Vektoren verwendet:
pTM1 als Plasmidvektor, VSV und BRSV als virale Vektoren. VSV wird dem Genus Vesiculovirus innerhalb der Familie Rhabdoviridae zugeordnet.
Die verschiedenen E2-Gene wurden kloniert und mit Hilfe von pTM1 durch Transfektion in BSR-T7/5-Zellen exprimiert. Das Ergebnis der Expressionsstudien spricht für ein Retentionssignal innerhalb des E2-Membranankers. Das zentrale Arginin im Membrananker stellt einen wichtigen Bestandteil des Retentionssignals dar, denn diese Mutation führt zur Oberflächenexpression des E2-Proteins.
Um E2-G(MT) (E2, welches den Membrananker und cytoplasmatischen Abschnitt von VSV-G enthält) mit Hilfe von VSV zu exprimieren, wurde das E2-G(MT)-Gen zwischen dem G- und L-Gen in das VSV-Antigenom einkloniert. Nach erfolgreichem Virus-Rescue wurden BHK-21-Zellen mit VSV-E2-G(MT) infiziert und die E2-G(MT)-Expression untersucht. E2-G(MT) wurde an der Zelloberfläche exprimiert und in VSV-E2-G(MT)-Virionen inkorporiert.
Die Proteine E2, E2-G(MT), E2-G(MT)Y/A (E2-G(MT), welches eine Punktmutation im cytoplamatischen Abschnitt enthält) und E2(MTdel) (E2 mit deletiertem Membrananker und cytoplasmatischem Abschnitt) wurden für die Expression mit dem viralen Vektor BRSV ausgewählt. Für diese Proteine wurde eine unterschiedliche Verteilung in infizierten Zellen erwartet. Die unterschiedliche Lokalisation der E2-Proteine kann bei einer späteren Immunisierung von Kälbern die Immunantwort gegen die rekombinanten BRS-Viren beeinflussen. Die E2-Gene wurden als zusätzliches Gen vor das NS1-Gen in das BRSV-Antigenom eingefügt.
Um die Integration der E2-Gene in das BRSV-Antigenom zu erleichtern, wurde eine Klonierungskassette mit Restriktionsschnittstellen und regulatorischen Sequenzen erstellt und und vor dem NS1-Gen in das Antigenom integriert. Nach erfolgreichem Virus-Rescue wurden verschiedene Zelllinien mit den rekombinanten Viren infiziert und die E2-Expression untersucht. Alle E2-Proteine wurden stark in infizierten Zellen exprimiert, wobei eine unterschiedliche zelluläre Verteilung zu beobachten war: E2 war im ER lokalisiert, während E2-G(MT) und E2-G(MT)Y/A an der Zelloberfläche exprimiert wurden. Interessanterweise wurden E2, E2-G(MT) und E2-G(MT)Y/A zusätzlich in den Überstand sezerniert. E2(MTdel) war ausschließlich im ER nachweisbar. Nach einer Virussedimentation durch ein Saccharosekissen konnten alle E2-Proteine zusammen mit den Virionen nachgewiesen werden, jedoch ist es derzeit nicht klar, ob die E2-Proteine in die BRS-Virionen integriert wurden oder ob sie mit diesen nur locker assoziiert waren.
Die viralen Vektoren VSV und BRSV sind gut geeignet zur Expression der E2-Proteine, wobei es zu einer hohen Expressionsrate der Fremdproteine kommt. Mit E2-exprimierendem BRSV ist es möglich, mit einem Virus gegen zwei Erkrankungen zu immunisieren. Aufgrund dieser Eigenschaft wird es zu einem interessanten Kandidaten für einen neuen Impfstoff.
9 Summary
Wiebke Köhl
Expression of E2 glycoprotein of BVDV using plasmid- and virus-vectors
In most cases infections of immunocompetent cattle with bovine viral diarrhea virus (BVDV), a Pestivirus of the family Flaviviridae, cause only mild clinical symptoms or are asymptomatic. However, transplacental transmission of BVDV is able to induce abortion, stillbirth, malformations and persistently infected calves, which die after 6 to 24 months of mucosal disease. Bovine respiratory syncytial virus (BRSV), a Pneumovirus of the family Paramyxoviridae, is the major cause of lower respiratory tract disease in young calves at the age between 4 weeks and 6 months.
E2 protein is the target of the protective immune response elicited by a BVDV infection. E2 is retained in the endoplasmic reticulum (ER) of infected cells.
We have constructed different chimeric, truncated and mutated forms of the E2 protein to examine the expression, transport and localization of E2. In chimeric E2 proteins the membrane anchor and/or cytoplasmic tail of E2 was exchanged against the corresponding regions of BRSV-F-protein or vesicular stomatitis virus (VSV) G protein. The truncated forms of the E2 protein had deletions in their cytoplasmic tail and/or membrane anchor. Additionally, E2 proteins were constructed with a point mutation in the middle of the membrane anchor, replacing an arginine residue by an alanine. For expression of the different E2 proteins three vectors were used: pTM1 as plasmid vector, VSV and BRSV as viral vectors. VSV is a member of the genus Vesiculovirus of the family Rhabdoviridae.
The different E2 genes were cloned and expressed with pTM1 by transfection of BSR-T7/5 cells. The results of these expression studies indicate, that there is a retention signal in the membrane anchor of E2. The central arginine in the membrane anchor is an important element of the retention signal in the E2 protein, because mutation resulted in surface expression of E2 protein.
To express E2-G(MT) (E2 containing the membrane anchor and cytoplasmic tail of VSV G) using VSV as vector, the E2-G(MT) gene was cloned between the G and L gene into VSV antigenome. After successful virus rescue, BHK-21-cells were infected with VSV-G(MT) and the expression of G(MT) was examined. E2-G(MT) was expressed at the cell surface and was incorporated into VSV-E2-E2-G(MT)- VSV-E2-G(MT)-virions.
The proteins E2, E2-G(MT), E2-G(MT)Y/A (E2-G(MT) containing a point mutation in the cytoplasmic tail) and E2(MTdel) (E2 with the membrane anchor and cytoplasmic tail deleted) were chosen for expression using BRSV as vector. These proteins are expected to have a different distribution in infected cells. The different localization of the E2 proteins may influence the immune response, when the recombinant viruses will be used to immunize calves. The E2 genes were inserted into the BRSV antigenome as additional gene upstream of the NS1 gene. To facilitate the insertion of the E2 genes into the BRSV antigenome, a cloning cassette with restriction sites and regulatory sequences was cloned and integrated into the antigenome upstream of the NS1 gene. After successful virus rescue, different cell lines were infected with the recombinant viruses and the expression of the E2-proteins was examined. Strong expression of all E2 proteins was observed with different cellular distribution: E2 was localized in the ER. E2-G(MT) and E2-G(MT)Y/A were expressed at the cell surface.
Interestingly E2, E2-G(MT) and E2-G(MT)Y/A were also secreted into the supernatant. E2(MTdel) was only detected in the ER. After virus sedimentation through a sucrose cushion all E2 proteins were detected together with BRSV, but at present it is not clear, whether the E2 proteins were integrated into BRSV virions or whether they were only associated with the virions.
The viral vectors VSV and BRSV are valuable tools for the expression of E2 proteins with high expression rates. With recombinant BRSV expressing the E2 proteins it is possible to immunize with one virus against two diseases. Therefore, these viruses are interesting candidates for a new vaccine.
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