molekularbiologische Methoden

3.1.1. Herstellung kompetenter Zellen (RbCl-Methode)

Die Herstellung kompetenter E.coli DH5α-Zellen erfolgte mittels Rubidiumchlorid.

Es wurde eine Vorkultur mit einem Aliquot (100 µl) RbCl-kompetenten DH5α-Zellen in 5 ml SOB-Medium angesetzt und über Nacht bei 37 °C und 220 rpm inkubiert. Am nächsten Tag wurde mit 1 ml der Vorkultur eine 100 ml Hauptkultur angeimpft und bei 37 °C und 220 rpm inkubiert bis eine OD550 von 0,5 erreicht wurde. Dann wurde die Hauptkultur in eiskalten 50 ml Reaktionsgefäßen 10 min bei 2800 x g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Zellsedi-ment in 12,5 ml Lösung I resuspendiert und erneut 10 min bei 2800 x g und 4 °C zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurde das Zellsediment in 8 ml eiskalter Lösung II resuspendiert. Die Zellsuspension wurde à 100 µl aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die kompetenten Zellen wurden bis zur Verwendung bei –80 °C aufbewahrt.

3.1.2. Transformation von E.coli DH5α

Für die Transformation wurde pro Plasmid ein Aliquot kompetenter E.coli DH5α-Zellen langsam auf Eis aufgetaut. Zu den aufgetauten DH5α-Zellen wurden 5 µl des Mutageneseansatzes (3.1.7.) bzw. 100 ng Plasmid-DNA zugefügt und 30 min auf Eis inkubiert. Zur Aufnahme des Plasmides wurden die Zellen 90 s bei 42 °C er-hitzt und dann 2 min auf Eis gekühlt. Die Transformationsansätze wurden mit 900 µl LB-Medium versetzt und 60 min bei 37 °C und 220 rpm inkubiert. Danach wurden die Ansätze 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert und 600 µl des Überstandes abgenommen und verworfen. Das Zellsediment wurde im restlichen Überstand resuspendiert und auf LB-Agarplatten (10 µg/ml Kanamycin enthaltend) mit einem Glasspatel ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37 °C konnten die Kolo-nien von der Platte gepickt und für weitere Versuche verwendet werden. Als Posi-tivkontrolle wurde das jeweilige Ausgangsplasmid und als NegaPosi-tivkontrolle nicht transformierte kompetente Zellen mitgeführt.

3.1.3. Animpfen einer Vor- bzw. Hauptkultur

Zum Ansetzen einer Vorkultur wurden 5 ml LB-Medium, 10 µg/ml Kanamycin ent-haltend, mit 1 µl Glyzerinstockkultur bzw. einer gepickten Kolonie angeimpft und ca. 16 h bei 37 °C und 220 rpm inkubiert.

Beim Animpfen der Hauptkultur wurden 100 ml LB-Medium, 10 µg/ml Kanamycin enthaltend, mit 100 µl der Vorkultur angeimpft und ca. 24 h bei 37 °C und 220 rpm inkubiert.

3.1.4. Anlegen eines Glyzerinstocks

Zur Lagerung der transformierten-kompetenten Zellen wurden 850 µl Vorkultur mit 150 µl Glyzerin gemischt und bei –80 °C gelagert. Um die Zellen wieder in Kultur zu bringen, wurde wie unter 3.1.3. beschrieben eine Vorkultur angelegt.

3.1.5. Plasmidpräparation 3.1.5.1. Minipräparation

Zur Gewinnung von Plasmid-DNA wurden transformierte E.coli-Zellen einer Plasmidpräparation unterzogen. Die Präparation erfolgte mittels des kommerziell erhältlichen Minipräparationskits „QIAprep^® Minipreps“ von Qiagen.

Für die Präparation wurde die am Tag zuvor angeimpfte Vorkultur (3.1.3.) geern-tet. Die nachfolgenden Präparationsschritte erfolgten alle bei RT. Dazu wurde die Vorkultur nacheinander in einem 2 ml Reaktionsgefäß jeweils 5 min und 10.000 x g zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes wurde das Zellsediment in 250 µl Zellsuspensionslösung resuspendiert. Zur Zelllyse wurde die Zellsuspen-sion mit 250 µl Zelllyselösung versetzt, durch Invertieren gemischt und 5 min inkubiert. Danach wurden 350 µl Neutralisationspuffer hinzugefügt, invertiert und 10 min bei 14.000 x g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde ohne Zellbe-standteile auf die im Kit enthaltene Miniprep-Säule überführt und 1 min bei 16.000 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen, die Säule mit 500 µl Waschlösung gewaschen und erneut nach obigen Angaben zentrifugiert. Der Waschschritt wurde mit 750 µl Waschlösung wiederholt. Zur vollständigen Entfer-nung der Waschlösung wurde die Säule 2 min bei 14.000 x g zentrifugiert. Die tro-ckene Säule wurde in ein steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und zur Elution der Plasmid-DNA mit 50 µl nukleasefreiem H2O versetzt. Nach einminütiger

Inku-bation wurde die DNA durch Zentrifugation bei 14.000 x g 1 min eluiert. Die Be-stimmung des DNA-Gehaltes (siehe 3.1.6.) erfolgte spektroskopisch. Die Plasmidpräparation wurde bei – 20 °C aufbewahrt.

3.1.5.2. Maxipräparation

Um große Mengen des Plasmides für die Transfektion eukaryotischer Zellen zu erhalten, wurde die Präparation mit dem „NucleoBond^® Plasmid Purification Sys-tem–Kit“ von Macherey-Nagel durchgeführt.

Für die Präparation wurde zunächst wie unter 3.1.3. beschrieben eine Vorkultur und dann eine Hauptkultur angesetzt. Die Zellen der Hauptkultur wurden in einem 50 ml Reaktionsgefäßen durch 15minütige Zentrifugation bei 4 °C und 6.000 x g geerntet. Das erhaltene Zellsediment wurde in 12 ml Resuspensionspuffer mit RNase aufgenommen. Die Zelllyse erfolgte durch Zugabe von 12 ml Lysepuffer und anschließender fünfminütiger Inkubation bei RT. Nach Zugabe von 12 ml Neu-tralisationspuffer wurde 5 min auf Eis inkubiert. Das Zellysat wurde zur Klärung durch einen NucleoBond^® Folded Filter gefiltert. Inzwischen wurde eine im Kit ent-haltene Maxiprep–Säule mit 6 ml Äquilibrierungspuffer äquilibriert. Der klare Über-stand wurde auf die äquilibrierte Säule gegeben und der Durchfluss verworfen.

Danach wurde die Säule mit 32 ml Waschpuffer gewaschen. Zur Elution der Plasmid-DNA wurden 15 ml Elutionspuffer auf die Säule gegeben und der Durch-fluss in einem 50 ml Reaktionsgefäß aufgefangen. Die DNA-Fällung erfolgte durch Zugabe von 11 ml eiskaltem Isopropanol. Nach Mischen des Ansatzes wurde bei 10.500 x g und 4 °C für 30 min zentrifugiert. Das erhaltene DNA-Pellet wurde vor-sichtig mit eiskaltem 70 %igen Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert (10 min, 4 °C und 15.000 x g). Das Pellet wurde an der Luft getrocknet und mit 100 µl nukleasefreiem H2O versetzt. Um die DNA möglichst vollständig wieder zu lösen, wurde das Pellet über Nacht bei 4 °C mit dem nukleasefreiem H2O inku-biert. Die Bestimmung des DNA-Gehaltes (siehe 3.1.6.) erfolgte spektroskopisch.

Anschließend wurde die DNA-Konzentration mit nukleasefreiem H2O auf 1 µg/µl eingestellt.

3.1.6. Bestimmung der DNA-Konzentration

Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte photometrisch, dazu wurde die Extinktion einer 1:50 verdünnten DNA-Lösung aus der Minipräparation (3.1.5.1.) bzw. 1:100 verdünnten Maxipräparation (3.1.5.2.) bei 260 nm in einer Quarzküvet-te bestimmt und nach folgender Formel der DNA-Gehalt berechnet:

sfaktor Verdünnung E

l g

c_DNA(μ /μ )=50* ₂₆₀ *

Zur Bestimmung der Reinheit des Plasmids wurde außerdem die Extinktion der Probe bei 280 nm bestimmt und der Quotient aus E260/E280 gebildet. Eine nahezu proteinfreie Probe weist einen Quotient zwischen 1,8 und 2,2 auf.

3.1.7. Mutagenese - PCR

Um die gewünschten Mutanten zu erzeugen, wurde die QuickChange™ Site-Directed-Mutagenese durchgeführt.

Für die Mutagenese wurden zwei zueinander komplementäre Mutageneseprimer mit einer Länge von ca. 30 bp verwendet, die etwa in der Mitte der Sequenz die gewünschte Veränderung tragen. Mit diesen Primern, dem Ausgangsplasmid und der Pfu-Turbo-DNA-Polymerase wurde die jeweilige Mutagenese-PCR mit der in

Abb. 3.1. schematische Darstellung der QuickChange™ Site-Directed Mutagenesemethode Ausgangs-

plasmid

Plasmidmutante mit Einzelstrangbrüchen

Plasmidmutante DpnI

1. Plasmid-präparation

2. Denaturierung der Plasmid-DNA, Anlagerung der

Mutageneseprimer Mutagenese- primer

3.

DNA-Synthese durch Pfu Turbo-DNA-Polymerase

4. Verdau des Ausgangsplasmides mit DpnI

5. Transformation des mutierten Plas-mides

Tab. 3.1. aufgeführten Zusammensetzung durchgeführt. Zur Verringerung der Se-kundärstruktur und zur Erleichterung der Strangtrennung wurde dem Ansatz 5 % DMSO hinzugefügt.

Tab. 3.1. Zusammensetzung eines Mutagenese-PCR-Ansatzes

Komponenten Menge im Ansatz

10 x Pfu-Reaktionspuffer Ausgangsplasmid (10 ng/µl) Sense Mutageneseprimer (125 ng/µl) Antisense Mutageneseprimer (125 ng/µl)

dNTP-Mix DMSO Nuklease freies H2O Pfu-DNA-Polymerase

1 x 10 ng 125 ng 125 ng 10 mM 5 % ad. 50 µl

1 µl

Als Negativkontrolle wurde ein Mutageneseansatz ohne Ausgangsplasmid mitge-führt. Die Mutagenese-PCR erfolgte nach dem in Tab. 3.2. angegebenen Pro-gramm.

Tab 3.2. Mutagenese-PCR-Programm

Schritt Zyklen Temperatur Zeit

1 einleitende Denaturierung 1 95 °C 5 min

2 Denaturierung Annealing der Primer

Elongation

18 95 °C

60 °C 68 °C

1 min 1 min 17 min*

3 abschließende Elongation 1 68 °C 10 min

4 4 °C ∞

*abhängig von der Größe des Vektors, bei pEGFP_CtIP-wt_C1 17 min

3.1.8. DpnI-Verdau

Zur Entfernung des Ausgangsplasmids wurde dem Mutageneseansatz 10 U DpnI zugesetzt und 2 h bei 37°C inkubiert. Das Restriktionsenzym DpnI schneidet methyliertes E.coli Ausgangsplasmid an einer Erkennungssequenz von 4 Nukleotiden in viele kleine DNA-Fragmente, während in vitro synthetisierte DNA nicht methyliert ist und somit nicht geschnitten wird.

3.1.9. Agarosegelelektrophorese

Mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese ist es möglich, unter anderem DNA-Plasmide und DNA-Fragmente aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe und somit eines unterschiedlichen Wanderungsverhaltens im Gel zu trennen. Die Methode diente der Überprüfung der Mutagenese-PCR. Zunächst wurde ein 1 %iges Aga-rosegel gegossen.

Agarosegel: 0,5 g Agarose

50 ml 1 x TBE Puffer

10 µl des Mutageneseansatzes nach DpnI-Verdau wurden mit 2 µl 6x Ladepuffer versetzt und aufgetragen. Als Positivkontrolle wurden 100 ng des Ausgangs-plasmides (in 10 µl H2O) mit 2 µl 6x Ladepuffer mitgeführt. Weiterhin wurde ein DNA-Standard mitgeführt, um den Fragmenten ihre entsprechende Größe zuord-nen zu könzuord-nen. Die Elektrophorese erfolgte 60 min bei 90 V. Nach anschließender Färbung des Geles im Ethidiumbromidbad (0,5 µg/ml) erfolgte die analytische Auswertung unter kurzwelliger UV-Bestrahlung mit Hilfe des „ChemiSmart 5000“.

3.1.10. Sequenzierung

Die Sequenzierung diente der Überprüfung der Sequenz, der bei der Mutagenese erhaltenen Plasmide. Diese Plasmide (mind. 300 ng) sowie die Primer wurden zur Sequenzierung an Qiagen geschickt.

Die identifizierten Sequenzen wurden mit Hilfe des Programmes „BioEdit“ betrach-tet und anschließend durch Benutzung von „CLC Sequence Viewer 5“ mit den Zielsequenzen verglichen.