Immunologische Methoden

In der vorliegenden Arbeit wurden immunologische Methoden vor allem dazu ge-nutzt, das Reparaturverhalten in der G1- und G2-Phase verschiedener Prote-in-defizienter Zellen zu untersuchen. Dazu wurden exponentiell auf Deckgläschen wachsende Zellen, wie unter 3.2.4. beschrieben, bestrahlt und nach Bestrahlung zur Vermeidung der Auswertung bestrahlter S-Phase-Zellen in der G2-Phase mit Aphidicolin (3 µg/ml) und zur Vermeidung der Auswertung bestrahlter G2-Phase-Zellen in der G1-Phase mit Nocodazol (100 µg/ml) versetzt.

3.2.7.1. Fixierung der Zellen mit Formaldehyd

Nach Ablauf der Reparaturzeit wurde das Medium abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen und 15 min bei RT zur Fixierung mit 2,5 % Formaldehyd/PBS inkubiert. Die Zellen wurden nach dreimaligem Waschen mit PBS 10 min bei 4 °C mit 0,25 % TritonX-100/PBS/1%FCS zur Permeabilisierung der Zellmembran be-handelt. Nach erneutem dreimaligem Waschen mit PBS/1%FCS wurden die Zel-len 30 min bei RT mit 5 %iger BSA/PBS/1%FCS-Lösung blockiert. Bis zur weite-ren Verwendung konnten die fixierten Deckgläschen bei 4 °C gelagert werden.

Bei den BrdU-Färbungen musste vor der Fixierung das Cytoplasma entfernt wer-den, dazu wurden die Zellen nach Ablauf der Reparaturzeit 5 min bei RT mit 0,5 % TritonX-100/PBS vorextrahiert. Um den Verlust von Zellen zu vermeiden, wurden alle folgenden Schritte nicht unter Schwenken durchgeführt. Anschließend 20 min mit 2,5 % Formaldehyd/PBS fixiert und erneut 20 min mit 0,5 % TritonX-100/PBS permeabilisiert. Nach 20minütigem Blocken bei RT mit 5 % BSA/PBS konnten die fixierten Deckgläschen bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert werden.

3.2.7.2. Rad51/γH2AX - Doppelfärbung

Um die Auswertung von γH2AX- und Rad51-Foci in ein- und derselben Zelle zu ermöglichen, wurde dieser Doppelfärbeansatz gewählt. Die unter 3.2.7.1. fixierten Zellen wurden über Nacht mit 25 µl Primärantikörperlösung (mouse anti-γH2AX (Ser139) 1:1000, rabbit anti-Rad51 1:15.000) inkubiert. Am nächsten Tag wurden die fixierten Zellen 3 mal 10 min unter Schwenken mit PBS/1%FCS gewaschen und anschließend 1 h mit 25 µl Zweitantikörperlösung (goat anti-rabbit Alexa Flu-or^®488 1:1000, goat anti-mouse Alexa Fluor^®594 1:1000) unter lichtgeschützen Bedingungen inkubiert. Nach erneutem dreimaligem Waschen mit PBS schloss

sich die unspezifische Färbung der DNA mit 0,2 µg/ml DAPI-Lösung für 4 min an.

Anschließend wurden die Zellen für 10 min gewaschen, mit je 3 μl Mounting Medi-um eingedeckelt und mit Nagellack versiegelt. Die gefärbten Zellen konnten bis zur Auswertung lichtgeschützt bei 4°C gelagert werden.

Die Auswertung der Foci erfolgte zellzyklusphasenspezifisch unter Benutzung der Metafer-Software wie unter 3.2.7.5.1. beschrieben.

3.2.7.3. BrdU-Resektion/CENP-F - Doppelfärbung

Dieser Färbeansatz diente dem Nachweis resektierter Doppelstrangbrüche in der G2-Phase. Die Färbung beruht auf dem Einbau von BrdU in die DNA anstelle des Thymidins während der Replikation. Hierfür mussten die Zellen 24 h mit BrdU (15 µM) markiert werden. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewa-schen, bevor nach Zugabe von frischem Medium bestrahlt werden konnte. Nach Ablauf der Reparaturzeit wurden die Zellen fixiert (siehe 3.2.7.1.).

Die fixierten Zellen wurden über Nacht und bei 4 °C mit 25 µl Erstantikörperlösung (FITC mouse anti-BrdU 1:5, rabbit anti-CENP-F 1:1000) inkubiert und am nächs-ten Tag dreimal 10 min mit PBS/1%FCS gewaschen. Anschließend erfolgte die einstündige Inkubation mit dem Zweitantikörper (goat anti-rabbit Alexa Fluor^®594 1:1000, goat anti-mouse Alexa Fluor^®488 1:1000) unter lichtgeschützten Bedin-gungen bei RT. Nach erneutem dreimaligem Waschen mit PBS wurde die DNA unspezifisch für 4 min mit 0,2 µg/ml DAPI-Lösung gefärbt. Im Anschluss erfolgte ein vierminütiger Waschschritt mit PBS, bevor die Zellen mit 3 μl Mounting Medi-um eingedeckelt und mit Nagellack versiegelt werden konnten. Bis zur Auswer-tung wurden die Proben bei 4 °C gelagert.

Die Auswertung erfolgte zellzyklusphasenspezifisch unter Benutzung des CENP-F-Signals und der Metafer-Software wie unter 3.2.7.5.2. beschrieben.

3.2.7.4. BrdU-Einbau/CENP-F - Doppelfärbung

Die BrdU-Einbau/CENP-F – Doppelfärbung kann als Nachweis abgeschlossener homologer Rekombination genutzt werden. Hierfür müssen die Zellen erst nach Bestrahlung und dann bis zum Ablauf der Reparaturzeit mit BrdU (15 µM) markiert werden.

Nach der Fixierung (3.2.7.1) erfolgt die Inkubation des 1. Primärantikörpers über Nacht und bei 4 °C (rabbit anti-CENP-F 1:1000). Am folgenden Tag wurden die

Zellen zweimal mit PBS/1%FCS und einmal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde für 20 min ein Crosslink mit 2,5 % Formaldehyd/PBS bei RT durchgeführt.

An ein erneutes einmaliges Waschen mit PBS und ein zweimaliges mit PBS/1%FCS schloss sich die Inkubation des 2. Primärantikörpers (mouse anti-BrdU, Roche 1:200) an. Zur Denaturierung der DNA befand sich der Antikörper im Inkubationspuffer (Roche) mit DNAse (1 µg/ml) und wurde für 2-3 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS/1%FCS gewaschen und 1 h mit 25 µl Zweitantikörperlösung (goat anti-rabbit Alexa Fluor^®488 1:1000, goat anti-mouse Alexa Fluor^®594 1:1000) unter lichtgeschützten Bedingungen bei RT inkubiert. Nach erneutem dreimaligem Waschen mit PBS konnte die DNA un-spezifisch für 4 min mit 0,2 µg/ml DAPI-Lösung gefärbt werden. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, bevor sie mit je 3 μl Mounting Medium eingedeckelt und mit Nagellack versiegelt wurden. Bis zur Auswertung erfolgte die Lagerung bei 4 °C.

Die zellzyklusphasenspezifische Auswertung erfolgte anhand der Analyse des CENP-F-Signals sowie der Benutzung der Metafer-Software (3.2.7.5.2).

3.2.7.5. Auswertung der immunologischen Methoden 3.2.7.5.1. Auswertung der γH2AX/Rad51-Färbung

Die Anzahl der γH2AX-Foci korrelliert mit der Anzahl der unreparierten DNA-Doppelstrangbrüche. Zur Beurteilung des Reparaturverhaltens verschiedener defi-zienter Zellen wurde die Abnahme der γH2AX-Foci nach Ablauf verschiedener Reparaturzeiten gemessen. In den exponentiell wachsenden Zellen wurden in der Regel G1- und G2-Zellen ausgewertet. Die Unterscheidung der Zellzyklusphasen erfolgte automatisch mit Hilfe der Metafer-Software, wobei die DAPI-Intensität ge-gen das γH2AX-Signal aufgetrage-gen wurde. Die G2-Zellen zeige-gen aufgrund des doppelten DNA-Gehaltes ein intensiveres DAPI-Signal im Vergleich zu G1-Zellen mit einfachem DNA-Gehalt. Zellen in der S-Phase, die einen DNA-Gehalt zwi-schen G1 und G2 aufweisen, konnten aufgrund des flächigen γH2AX-Signals in-folge der Aphidicolinbehandlung ausgeschlossen werden. Die ausgewählten Zel-len konnten aufgrund der Relokalisationsfunktion der Software angefahren und direkt am Mikroskop bei 1000facher Vergrößerung ausgewertet werden. Bei jedem Datenpunkt wurden mindestens 40 Zellen ausgewertet, dabei mussten mindes-tens 40 Foci erreicht werden.

3.2.7.5.2. Auswertung der BrdU/CENP-F-Färbung

Die BrdU-Foci korrelieren mit der Anzahl der resektierten DSBs bzw. den über HR reparierten DSBs. Zur Beurteilung des Reparaturverhaltens wurden die BrdU-Foci nach verschiedenen Reparaturzeiten in G2 gemessen. Die Unterscheidung der Zellzyklusphasen erfolgte automatisch mit Hilfe der Metafer-Softwar, wobei die DAPI-Intensität gegen das CENP-F (Centromer-F)-Signal aufgetragen wurde.

CENP-F weist eine flächige Kernfärbung auf, die in der G2-Phase deutlich intensi-ver ist als in der späten S-Phase. Um die späten S-Phasen aus der Auswertung auszuschliessen, konnte weiterhin das BrdU-Signal bewertet werden, welches in den S-Phase-Zellen deutlich intensiver als in den G2-Zellen ist. Die ausgewählten G2-Zellen konnten mit Hilfe der Relokalisationsfunktion der Software angefahren werden und direkt am Mikroskop bei 1000facher Vergrößerung ausgewertet wer-den. Bei jedem Datenpunkt wurden mindestens 40 Zellen ausgewertet, dabei mussten mindestens 40 Foci erreicht werden.

3.2.8. Proteinanalytische Methoden