Migration von CD34DC auf dermale Faktoren hin

Zunächst wurde die Migration von CD34DC in das dermale Kompartiment untersucht.

Um den Einfluss des Mikromilieus in der Dermis zu untersuchen, wurde konditioniertes Medium von Fibroblasten (FCM) gewonnen und in der unteren Kammer des Transwell als Chemoattraktans für CD34DC eingesetzt. Die Transwell-Membran war in diesen Versuchen mit Matrigel™ und Endothelzellen beschichtet. Nach vier Stunden wurden die migrierten CD34DC gezählt und immunzytometrisch analysiert. Die Anzahl spezifisch in FCM migrierter CD34DC schwankte in den Experimenten sehr stark. Dennoch konnte beobachtet werden, dass innerhalb der CD34DC die CD14_pos Zellen am stärksten in das FCM migrierten.

Die spontane Migration der anderen Subpopulationen (CTL) wurde durch FCM nur leicht verstärkt (Abb.3.3.1).

-10 0 10 20 30 40 50 60

CD14pos DP DN CD1a pos

Subpopulationen der CD34DC Migrierte Zellen (% der Ausgangspopulation)

FCM CTL

Abb.3.3.1 Migration von CD34DC auf Fibroblasten-konditioniertes Medium (FCM) hin CD34DC wurden an d7 auf die mit Matrigel™ und Endothelzellen beschichte Transwell-Membran gegeben. In der unteren Kammer war als chemoattraktiver Stoff FCM oder als Kontrolle das unkonditionierte Fibroblasten-Medium (CTL). Nach vier Stunden wurden die migrierten Zellen in der unteren Kammer gezählt und mit spezifischen Antikörpern gegen CD1a und CD14 gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Gezeigt sind die migrierten Subpopulationen als prozentuale Verteilung im Bezug zu den Ausgangspopulationen.

Dargestellt ist der Mittelwert von n=3 +/- SD

MCP-1 war eines der Chemokine, das in dem konditionierten Medium von Fibroblasten und Endothelzellen mit Hilfe des Chemokin-Array Tests nachgewiesen wurde. Nachdem MCP-1 schon als starkes Chemoattraktans für Monozyten bekannt ist (Fantuzzi et al., 1999), wurde die chemoattraktive Wirkung von rekombinantem MCP-1 auf CD34DC untersucht. Daneben wurde ein anti-MCP-1 Antikörper eingesetzt, der die Wirkung von MCP-1 neutralisieren sollte. Vor Migration wurde der anti-MCP-1 Antikörper zusammen mit dem rekombinanten

MCP-1 für 30 min. inkubiert, bevor die CD34DC in die obere Transwell-Kammer überführt wurden.

Ebenso wie in das FCM migrierte die CD14pos Subpopulation am stärksten spezifisch auf das rekombinante MCP-1 zu. Die drei anderen Subpopulationen migrierten nur wenig stärker auf MCP-1 hin als auf die Mediumkontrolle. Die Zugabe des spezifischen anti-MCP-1 Antikörpers wirkte sich am stärksten auf die spezifische Migration der CD14pos

Subpopulation aus. Die Migration der CD1apos Zellen wurde durch die Zugabe des Antikörpers am geringsten beeinflusst (Abb.3.3.2).

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

CD14pos DP DN CD1a pos

Subpopulationen der CD34DC

MI

MCP-1 + anti-MCP-1

Abb.3.3.2 Migration von CD34DC auf MCP-1 hin; Inhibition durch einen anti-MCP-1 Antikörper

Die chemoattraktive Wirkung von humanem rekombinantem MCP-1 (10 ng/ml) wurde auf CD34DC untersucht. Hierfür wurden 1x 10⁶ CD34DC in die obere Kammer des Transwells gegeben, in der unteren Kammer befand sich die MCP-1 Lösung. Optional wurde vor dem Beginn der Migration zu der MCP-1 Lösung ein spezifischer anti-MCP-1 Antikörper (0,5 µg/ml) hinzugegeben. Nach vier Stunden wurden die migrierten Zellen in der unteren Kammer gezählt, mit spezifischen Antikörpern gegen CD14 und CD1a gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Dargestellt ist der MI der vier Subpopulationen eines repräsentativen Ergebnisses von n=6.

Nachdem gezeigt werden konnte, dass CD34DC spezifisch in FCM hinein und auf MCP-1 hin migrierten, wurde als nächstes die Rolle von MCP-1 in dem FCM untersucht. Hierfür wurde vor Beginn der Migration das FCM 30 min. mit dem spezifischen anti-MCP-1 Antikörper inkubiert, bevor die CD34DC in die obere Kammer überführt wurden. Nach vier Stunden wurden die migrierten Zellen in der unteren Kammer gezählt und immunzytometrisch analysiert. Wie schon in Abb.3.3.1 gezeigt, migrierten alle Subpopulationen spezifisch in das FCM. Der spezifische anti-MCP-1 Antikörper inhibierte die Migration aller Subpopulationen, wobei die Migration der CD14 exprimierenden Subpopulationen ein wenig stärker inhibiert wurde (Abb.3.3.3).

0 10 20 30 40 50 60

CD14 pos DP DN CD1a pos

Subpopulationen der CD34DC

Prozentt Inhibition

Abb.3.3.3 Inhibition der spezifischen Migration von CD34DC in FCM hinein durch einen anti-MCP-1 Antikörper

Der anti-MCP-1 Antikörper (0,5 µg/ml) wurde vor Beginn der Migration zu dem FCM gegeben. 1 x 10⁶ CD34DC wurden in die obere Transwell-Kammer gegeben und nach vier Stunden die migrierten Zellen in der unteren Kammer gezählt. Die migrierten Zellen wurden mit spezifischen Antikörpern gegen CD1a und CD14 gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Aufgetragen ist die Inhibition der spezifischen Migration der einzelnen Subpopulationen. Gezeigt ist der Mittelwert von n=2 (+/- SD).

Mit diesem Experiment konnte gezeigt werden, dass von MCP-1 ein Teil der chemoattraktiven Wirkung von FCM auf CD34DC abgeleitet werden kann. Um die Wirkweise von MCP-1 genauer zu untersuchen, wurden die Zellen vor und nach Migration auf die Expression von CCR1 und CCR2 durchflusszytometrisch untersucht. Diese beiden Chemokinrezeptoren sind die spezifischen Rezeptoren für MCP-1; sie konnten, wie schon in Abschnitt 3.1. beschrieben, nur in geringer Dichte mit immunzytometrischen Methoden auf der Oberfläche der CD34DC nachgewiesen werden. Es konnte kein migrationsspezifischer Effekt auf die Expression von CCR1 und CCR2 in der FACS-Analyse gezeigt werden, die CD14_pos Zellen waren auch nach Migration die einzigen CD34DC, die CCR2 exprimierten.

CCR1 konnte auch nach Migration nicht auf den CD34DC nachgewiesen werden (nicht gezeigt).

Um mit einer zweiten Methode diesen Befund genauer zu analysieren, wurde mRNA aus den migrierten CD34DC aufgereinigt, um mit spezifischen Oligonukleotiden die Gen-Expression von CCR1 und CCR2 nachzuweisen. Auch mit dieser zweiten Analysemethode konnten keine Effekte auf die Expression von CCR1 und CCR2, hervorgerufen durch die Migration in FCM oder auf MCP-1 hin, gefunden werden (nicht gezeigt).

Die Experimente zur Migration der CD34DC in das dermale Milieu zeigten, dass bevorzugt die CD14-exprimierenden CD34DC auf Faktoren reagierten, die von Fibroblasten sezerniert wurden. Als einer dieser Faktoren konnte MCP-1 identifiziert werden, da ein spezifischer anti-MCP-1 Antikörper die gezielte Migration von CD34DC inhibieren konnte. Über die

Funktion der Chemokinrezeptoren kann durch diese Experimente keine eindeutige Aussage gemacht werden, da nur die CD14-positive Subpopulation den hochaffinen Rezeptor für MCP-1, CCR2, exprimierten, und sich dies auch nach Migration in FCM oder auf MCP-1 hin nicht änderte.

3.3.2 Sequenzielle Migration von Monozyten auf Faktoren dermaler