Aus Stammzellen (CD34 pos Zellen) generierte DC

Abb.3.1.10 Expression von αααα-Integrinen CD49b-f in Monozyten, MoDC d3 und d7 und CD34DC

Die mRNA aus Monozyten, MoDC an d3 und d7 wurde aufgereinigt und mit RT-PCR umgeschrieben. Mit Hilfe von spezifischen Oligonukleotiden wurde die Genexpression von CD49b, CD49c, CD49d, CD49e und CD49f nachgewiesen. Als konstitutiv exprimiertes Gen wurde als Kontrolle β-Aktin nachgewiesen. Die Ergebnisse der RT-PCR der CD34DC werden in Abschnitt 3.1.2 besprochen.

Von CD49b, CD49c, CD49d, CD49e und CD49f konnte mRNA sowohl in Monozyten als auch in MoDC nachgewiesen werden (Abb.3.1.10). Während der Differenzierung von Monozyten zu MoDC nahm die nachweisbare Konzentration der mRNA von CD49f ab.

Die Phänotypisierung der Monozyten und MoDC zeigte zum einen, dass Monozyten durch Zugabe von GM-CSF und IL-4 schon nach drei Tagen zu MoDC differenzierten. Monozyten exprimierten die untersuchten Chemokinrezeptoren, mit Ausnahme von CCR6, stärker auf der Oberfläche als die MoDC. Die Expression der Integrine auf der Zelloberfläche nahm bei den MoDC ebenfalls mit zunehmender Differenzierung ab, wobei die Expression der mRNA der α-Integrine mit Ausnahme von CD49f konstant blieb.

Insgesamt zeigte sich, dass Monozyten sowohl die Chemokinrezeptoren als auch die Integrine stärker als die MoDC exprimierten. Da die MoDC aus den Monozyten generiert wurden, könnte die Abnahme der für die Immigration in die Gewebe relevanten Faktoren Hinweise auf die in vivo Situation geben, da Immigration von Monozyten in ein Gewebe zur Differenzierung führt (Randolph et al., 1998).

coexprimierten CD14 und CD1a (doppelpositive Zellen (DP Zellen)). Der größte Teil der Zellen war CD14- und CD1a-negativ (doppelnegative Zellen (DN Zellen)).

Abb.3.1.11 Differenzierung von CD34pos Zellen zu CD34DC

CD34pos Zellen wurden aus frischem Nabelschnurblut aufgereinigt und in Kultur genommen.

An d4 und d7 wurden die kultivierten Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen CD14 (gekoppelt an APC) und CD1a (gekoppelt an PE) gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. In die Analyse wurden nur lebende Zellen, die nach Färbung mit 7-AAD negativ waren, einbezogen. Dargestellt ist die Fluoreszenz von APC und PE auf den Zellen als Punktdiagramm. Der Quadrant wurde aufgrund der Färbung mit unspezifischen Antikörpern gleichen Isotypes gesetzt. CD14-positive Zellen = violette Punkte, doppelt positive Zellen (DP) = blaue Punkte, doppelt negative Zellen (DN) = hellblau, CD1a-positive Zellen = grüne Punkte.

Expression von Chemokinrezeptoren auf CD34DC

Im Vergleich zu den oben beschriebenen Monozyten exprimierten die CD34DC die untersuchten Chemokinrezeptoren geringer, abweichend davon war jedoch die starke Expression von CCR6 auf den CD34DC (Abb.3.1.12). CCR1 wurde nur an d4 auf den CD14pos CD34DC nachgewiesen, allerdings sehr schwach exprimiert. An d7 waren alle CD34DC CCR1-negativ (Abb.3.1.12). Dennoch wurde mit RT-PCR CCR1-spezifische mRNA in den CD34DC nachgewiesen (Abb.3.1.7). CCR2 wurde nur auf der Oberfläche von CD14_pos Zellen nachgewiesen, die Expression war jedoch sehr niedrig und blieb bis d7 auf diesem Niveau. CX₃CR1 wurde nur sehr gering hauptsächlich auf den CD14_pos CD34DC exprimiert. Mit RT-PCR konnte in den CD34DC CX₃CR1 spezifische mRNA nachgewiesen werden (Abb.3.1.7).

Alle Subpopulationen der CD34DC waren an d4 CCR6-positiv (Abb.3.1.12). DP und CD1a_pos CD34DC exprimierten gleiche Mengen CCR6 auf der Oberfläche. CD14_pos und eine Subpopulation der DN Zellen exprimierten ebenfalls CRR6, allerdings deutlich geringer als die beiden anderen Populationen. Auch an d7 waren alle Subpopulationen der CD34DC

CCR6-positiv, allerdings hatten DP CD34DC einen leicht höheren rFI Wert als die CD1a_pos Zellen. Diese auf CCR6 bezogenen Ergebnisse wurden durch RT-PCR bestätigt (Abb.3.1.7).

Kontrolle CCR6 CCR1 CCR2 CX₃CR1

CD14pos

d4

d7

CD1apos d4

d7

CD1apos d4

d7

DP

d4

d7

DP

d4

d7

DN

d4

d7

DN

d4

d7

Relative Zellzahl

Fluoreszenzintensität

Abb.3.1.12 Expression der Chemokinrezeptoren auf der Oberfläche von CD34DC

CD34DC wurden an d4 und d7 mit monoklonalen Antikörpern gegen CD14 und CD1a gefärbt, zusätzlich wurden sie mit spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen die Chemokinrezeptoren, die indirekt an FITC gekoppelt wurden, gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Die Subpopulationen der CD34DC wurden durch Quadrantenanalyse anhand der Färbung von unspezifischen Antikörpern gleichen Isotyps ermittelt. Aufgetragen ist die Zellzahl gegenüber der Fluoreszenzintensität der FITC-Färbung auf den analysierten CD34DC. Als Kontrolle für die FITC-Färbung wurde ein unspezifischer Antikörper gleichen Isotyps ausgewählt. Abgebildet ist ein repräsentatives Ergebnis von n=3.

Das Ergebnis der Chemokinrezeptor-Analyse zeigt, dass CD34DC, Monozyten und MoDC ähnliche Chemokinrezeptoren exprimierten. Die CD14_pos Subpopulation der CD34DC

exprimierte allerdings die untersuchten Chemokinrezeptoren deutlich geringer als die Monozyten. MoDC und die CD1a-positiven Subpopulationen der CD34DC exprimierten ein ähnliches Muster der untersuchten Chemokinrezeptoren.

Expression von Integrinen auf CD34DC

Wie für die MoDC wurden auch die Adhäsionsmoleküle auf der Zelloberfläche der CD34DC untersucht. Die β-Integrine CD18 und CD29 wurden auf den CD14_pos Zellen an d4 und d7 exprimiert (Abb. 3.1.13). An d4 war die Expression von CD18 und CD29 stärker als an d7.

Die anderen CD34DC Populationen waren ebenfalls CD18- und CD29- positiv, aber schwächer als die CD14_pos CD34DC.

Alle CD34DC exprimierten an beiden untersuchten Zeitpunkten das α-Integrin CD11a, jedoch wurde CD11a von den CD14_pos Zellen stärker exprimiert. CD11b wurde ebenfalls auf allen Subpopulationen nachgewiesen, wobei die DN CD34DC am geringsten CD11b exprimierten. Die DP Zellen exprimierten am stärksten CD11b auf ihrer Oberfläche; auf der Zelloberfläche von CD14pos CD34DC nahm die Expression von CD11b von d4 zu d7 ab.

CD11c wurde am stärksten von der DP Subpopulation exprimiert. Die Expression von CD11c nahm auf den DP und den CD1apos von d4 zu d7 leicht zu. Konstant blieb die Expression von CD11c auf den CD14pos und den DN Zellen, die am schwächsten CD11c exprimierten.

Die α-Integrine CD49b und CD49c konnten nicht auf der Zelloberfläche von CD34DC nachgewiesen werden (Abb.3.1.13). CD49d konnte nur an d7 auf den CD34DC nachgewiesen werden (nicht gezeigt). An beiden Zeitpunkten waren alle CD34DC CD49e-positiv (nicht gezeigt). CD49f wurde nur schwach von der DN Subpopulation an d4 und d7 exprimiert (Abb. 3.1.13).

Mit RT-PCR wurde die mRNA von den α-Integrinen CD49c, CD49d, CD49e und CD49f nachgewiesen (Abb.3.1.10). CD49b mRNA wurde nur in der DN Subpopulation nachgewiesen (nicht gezeigt).

Kontrolle CD18 CD29 CD11aCD11b CD11c CD49f d4

CD14posDPCD1apos

d7

d7 d4

d7

DN

d4

d7 d4

CD49c CD49b Fluoreszenzintensität

Relative Zellzahl

Abb. 3.1.13 Expression von Integrinen auf CD34DC an d4 und d7

CD34DC wurden an d4 und d7 mit monoklonalen Antikörpern gegen CD14 und CD1a gefärbt, zusätzlich wurden sie mit spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen die Integrine, die indirekt an FITC gekoppelt wurden, gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Die Subpopulationen der CD34DC wurden durch Quadrantenanalyse anhand der Färbung von unspezifischen Antikörpern gleichen Isotyps ermittelt. Aufgetragen ist die Zellzahl gegenüber der Fluoreszenzintensität der FITC-Färbung auf den analysierten CD34DC. Als Kontrolle für die FITC-Färbung wurde ein unspezifischer Antikörper eines Isotypen ausgewählt. Abgebildet ist ein repräsentatives Ergebnis von n=3.

Anders als bei der Differenzierung von Monozyten zu MoDC nahm die Expression der Integrine auf der Oberfläche der CD34DC nicht im Verlauf der Differenzierung pauschal ab.

Die Expression der Integrine blieb eher konstant auf den CD34DC, oder wurde in Einzelfällen von d4 zu d7 verstärkt. Die Subpopulationen der CD34DC exprimierten sowohl die α-Integrine wie auch die β-Integrine deutlich heterogener als die Monozyten und auch als die MoDC.

Die CD34DC Subpopulationen hatten sowohl bezogen auf die Expression der Chemokinrezeptoren wie auch der Integrine einen anderen Phänotyp, als die Subpopulationen

der Monozyten und auch der MoDC. Allerdings konnte durch die Differenzierung der Vorläuferzellen zu DC bei beiden Zelltypen Veränderungen bei der Expression der Adhäsionsmoleküle und Chemokinrezeptoren beobachtet werden.