Methodik der Vesikelaufreinigung

Das Aufreinigungsprotokoll der caninen Vesikel wurde in Orientierung an den bisher in der Literatur beschriebenen Maßnahmen zur Vesikelisolierung aus dem Ejakulat erstellt. In Kapitel 2 findet sich ein Überblick über das generelle Vorgehen der vesikulären Aufreinigung und dessen Hintergründe. In der vorliegenden Arbeit wurden die vielfältigen Vorschläge aus der Literatur aufgegriffen und in Vorversuchen (siehe 3.4) für die Aufarbeitung der caninen Vesikel überprüft. Hauptkriterium für die Auswahl der einzelnen Bearbeitungsschritte war die Abwesenheit von Spermien und sonstigem zellulärem, vesikelfremden Material und damit die Reinheit der letztendlich erhaltenen Vesikelprobe. Wichtig war allerdings auch eine Optimierung des Vesikelertrages aus dem Ejakulat. Da mit steigender Umdrehungszahl der Zentrifugationen vor der ersten Ultrazentrifugation lichtmikroskopisch ein erhöhter Verlust von Vesikeln in das abgetrennte Spermienpellet zu beobachten war, wurde die Umdrehungszahl so weit als möglich minimiert. Eine ausreichende Geschwindigkeit zur Abtrennung der Spermien und zellulären Strukturen musste jedoch gewährleistet bleiben und war damit ein limitierender Faktor für die Reduktion der g-Zahl. Andere Methoden zur vesikulären Isolierung, wie Filtern bzw. Dichtegradientenzentrifugation mittels Silikatmedium, führten zu einer mangelhaften Trennung von Spermien und Vesikeln bzw. zu einer Verunreinigung der Vesikelprobe mit Silikatmaterial und kamen daher nicht in Frage.

Das letztendliche Protokoll nutzte zur Abtrennung zellulären Materials im Vergleich zu den meisten anderen Protokollen aus genannten Gründen eine relativ niedrige, maximale g-Zahl vor der ersten Ultrazentrifugation. Zelli et al. (2013) und Ronquist et al. (2013), die ebenfalls mit Rüdensperma arbeiteten, zentrifugierten bei Umdrehungsgeschwindigkeiten von 5000 g bzw. 10000 g. Dies sichert eine hohe Reinheit der Probe, birgt jedoch auch die Gefahr einer verfälschten Analyse, weil hier mit hoher Wahrscheinlichkeit sehr große Vesikel vor der

Vesikeldurchmessers, sondern auch auf Protein- und Lipidanalyse und weitere Funktionsanalysen auswirken, weil bislang unklar ist, ob Vesikel unterschiedlicher Zusammensetzung und Funktion existieren, die bei diesem Protokoll nicht in die Auswertung miteingehen würden. Umgekehrt kann man argumentieren, dass eine sehr niedrige Umdrehungszahl, wie sie in der vorliegenden Arbeit oder auch bei der Isolierung von Vesikeln aus der Nebenhodenflüssigkeit des Hamsters (Légaré et al. 1999) verwendet wurde, die Reinheit der Vesikelprobe gefährdet und dadurch bei Untersuchung der Proteine oder Lipide zu Kontaminationen führt. Dies ist durchaus ein berechtigter Einwand. Daher wurde die Reinheit der Probe im Rahmen der Vorversuche sowohl licht– als auch elektronenmikroskopisch nach Protokollende, d.h. nach Gelchromatographie und zweiter Ultrazentrifugation, überprüft. Während lichtmikroskopisch in mehreren Gesichtsfeldern abgesehen von den Vesikeln kein zelluläres Material detektierbar war, waren im Elektronenmikroskop vereinzelt 500–800 nm lange, 150 nm breite, längsovale, stark elektronendichte Strukturen zu erkennen, die von einer Doppelmembran umschlossen wurden, welche meist an einem Ende der Struktur unterbrochen war. Diese Strukturen sowie ihr Inhalt waren nicht eindeutig identifizierbar. Es ist möglich, dass es sich hierbei um präparationsbedingt aufgeplatzte Vesikel handelt. Genauso könnten aber vesikelfremde Strukturen spermiden Ursprungs vorliegen. Das Vorkommen dieser Gebilde war vergleichsweise selten und wurde damit als vernachlässigbar eingestuft.

Das mehrstufige Verfahren des Zentrifugationsprotokolls vor der ersten Ultrazentrifugation hat seinen Ursprung im experimentellen Vorgehen zur Etablierung des Protokolls (siehe 3.4).

Eine einmalige Zentrifugation bei einer bestimmten Umdrehungszahl für eine bestimmte Zeitdauer würde dieses möglicherweise ersetzen können. Jedoch stellte sich genau das hier angewendete Verfahren im Rahmen der Vorversuche als eine zielführende Variante heraus und die hohe physikalische Resistenz der Vesikel machte eine weitere Vereinfachung nicht notwendig.

Zur Abtrennung der Vesikel von amorphen Anteilen des Seminalplasmas durch die Gelchromatographie wurden bisher meist Säulen mit Volumina von 40 bis etwa 85 ml verwendet (Fabiani et al. 1994b; Kelly et al. 1991; Arienti et al. 1999a; Palmerini et al. 2003;

Renneberg et al. 1997; Zelli et al. 2013). In der hier beschriebenen Studie kamen kleinere Säulen (26,5 ml) zum Einsatz, da deren Auftrennungskapazität für die untersuchten kleinen Probenmengen ausreichend war (telefonische Rücksprache mit Experten der

Technikabteilung der Firma GE Healthcare und experimentelle Bestätigung anhand von aussagekräftigen Elutionsdiagrammen). Außerdem verkürzte die Reduktion des Säulenvolumens bzw. der Säulenlänge die Durchlaufzeit der Probe. Dies erhöhte zum einen die Praktikabilität des Protokolls, zum anderen wurde eine möglichst geringe Gesamtdauer der Vesikelaufreinigung angestrebt, um im Rahmen des Tiefgefrierversuches die Lagerzeiten der Spermien vor der Kryokonservierung, innerhalb welcher die Vesikel der jeweiligen Rüden nach Samengewinnung aufgereinigt werden mussten, möglichst gering zu halten.

Die Säulenkapazität hinsichtlich der maximalen Proteinmenge der pro Elution aufgegebenen Probe wurde in Vorversuchen ermittelt. Bei Mengen im Bereich von 800–1000 µg ergab sich eine schlechte Auftrennung der Probe, die im Elutionsdiagramm keine Unterscheidung von einzelnen Peaks mehr möglich machte. Unter 800 µg war eine deutliche Darstellung eines einzelnen Peaks (Vesikel) zu Beginn der Elution und mehreren, teilweise zusammenhängenden, nachfolgenden Peaks (amorpher Anteil des Seminalplasmas) im weiteren Elutionsverlauf zu beobachten, die eine klare Zuordnung der Fraktionen zuließen.

Die Elutionsdiagramme gleichen denjenigen, die für andere Spezies in der Literatur beschrieben sind (Fabiani et al. 1994b; Stegmayr und Ronquist 1982a) und bestätigen damit die Möglichkeit des erfolgreichen Einsatzes einer Säule kleineren Volumens. Der Richtwert der maximalen Aufgabe von 30% des Säulenvolumens entstammt den Erfahrungen des Technik–Service der Firma GE Healthcare (telefonische Kommunikation). Die Flussrate, die hier von der Schwerkraft bestimmt wurde, lag in etwa bei 0,12 ml/min. Somit umfasste eine Fraktion etwa 0,36 ml, was im Vergleich zur Literatur (1-10 ml pro Fraktion) (Fabiani et al.

1994b; Renneberg et al. 1997; Kelly et al. 1991) sehr gering ist, jedoch eine hohe Genauigkeit des Elutionsdiagramms gewährleistete und somit an das geringere Säulenvolumen angepasst war. Der Abbruch der Elution nach 32 Fraktionen ergab sich experimentell, weil nach dieser Zeit alle relevanten Daten und Materialien gewonnen waren.

Falls die Vesikel nicht direkt weiter eingesetzt oder untersucht wurden, wurden sie bei-25 °C aufbewahrt. Dies sollte einer biochemischen Zersetzung von Lipid-und Proteinmolekülen vorbeugen. Für die Vesikel aus dem Ejakulat verschiedener Spezies ist eine hohe Resistenz gegen physikalische Einflüsse beschrieben, die sie beispielsweise Gefrierbehandlungen ohne strukturelle Schädigungen überstehen lassen (Sullivan 2008; Ronquist und Brody 1985;

Ghaoui et al. 2004). Daher ist eine derartige Konservierung der Vesikel gängig und wurde

auch für Vesikel des Rüden (bis –196 °C) angewendet (Zelli et al. 2013). Inwiefern neben der Struktur auch die vesikuläre Funktion erhalten bleibt, ist allerdings unklar.