Methoden zur Lokalisation von Proteinen

2.2.5.1 Isolierung von Chloroplasten aus Pisum sativum

Die Isolierung intakter Chloroplasten aus Erbsenpflanzen (Pisum sativum, Sorte "Kleine Rheinländerin") wurde in modifizierter Form nach Schindler et al. (1986) und Perry et al.

(1991) durchgeführt. Nach Anzucht der Erbsen für 10 Tage bei Raumtemperatur wurde das Blattgewebe mit Isolationsmedium in einen Küchenmixer (Braun) viermal je 2 s homogenisiert und anschließend durch zwei Lagen Nylongaze filtriert. Das Filtrat wurde bei 2 000 g 1 min zentrifugiert und das Pellet in 1 ml Waschpuffer (1 x HMS) resuspendiert. Um intakte von zerstörten Plastiden in der Rohplastidenfraktion zu trennen, wurde 1 ml dieser Fraktion auf ein 40 %iges Percoll-Kissen (9 ml) geschichtet und 5 min lang bei 2 000 g in einem Festwinkelrotor (SS34-Rotor, Sorvall) zentrifugiert. Zerstörte Plastiden lagen dem Kissen auf, wohingegen intakte Plastiden pelletierten. Das Pellet wurde in 1 x HMS-Puffer resuspendiert und erneut zentrifugiert (1 min, 2 000 g) und in einem kleinen Volumen 1 x HMS-Puffer (50-100 µl) aufgenommen.

Zur Chlorophyllbestimmung wurden 5-10 µlSuspension mit 80 % Aceton auf 1 ml aufgefüllt und die Extinktion bei 652 und 750 nm gemessen. Die Chlorophyll-Konzentration (µg/µl) errechnet sich aus: (OD₆₅₂-OD₇₅₀) x Verdünnungsfaktor/ 36.

Anhand der Chlorophyllbestimmung wurde die erforderliche Menge an Chloroplasten für weitergehende Analysen eingesetzt.

Isolationsmedium:

330 mM Sorbitol, 20 mM MOPS, 13 mM Tris, 3 mM MgCl2, 0,1 % BSA

Waschpuffer (1 x HMS):

330 mM Sorbitol, 50 mM Hepes/KOH, pH 7.6, 3 mM MgCl2

5 x HMS:

1.65 M Sorbitol, 250 mM Hepes/KOH, pH 7.6, 15 mM MgCl2

40 % Percoll-Kissen:

40 % Percoll (v/v), 40 % aqua bidest. (v/v), 20 % 5 x HMS

2.2.5.2 Import ³⁵S-markierter Proteine in Chloroplasten

Der in vitro Import wurde in 400-µl-Ansätzen durchgeführt. Die Ansätze enthielten 2 mM ATP, 20 mM Kalium-Gluconat, 5 mM Methionin, 20 mM NaHCO₃, 2 % Rinderserum-Albumin, 330 mM Sorbitol, 50 mM Hepes/KOH, pH 7.6, 3 mM MgCl₂ und 40 µl des ³⁵S-markierten

In-vitro-Translations-Produktes (Kap. 2.2.4.19). Das Import-Gemisch wurde für 30 min bei 25° C inkubiert.

Nach der Inkubation wurde der Import durch Zentrifugation (1 min, 1 000 g, 10° C) abgestoppt, in 300 µl Waschmedium aufgenommen, auf Eis gestellt und sofort weiterverarbeitet.

Der Ansatz wurde für die weiteren Schritte in 3 x 100 µl aliquotiert und wie im Schema angegeben weiterbehandelt:

Plastiden-Fraktion Thermolysin-Fraktion Triton-Fraktion + 1/10 Vol. 10 mM CaCl2 + 1/10 Vol.

Thermolysin-Stammlösung

+ 0.2 % (v/v) Triton X-100, 10 min RT, + 1/10 Vol. Thermolysin

10minütige Inkubation auf Eis

+ EDTA zu einer Endkonzentration von 10 mM

1 min, 1 000 g, 10° C + 4 Vol. Aceton

Waschen: +300 µl Waschmedium, 1 min, 1 000 g, 10° C 15 min, 20 000 g, 4° C, trocknen Die Pellets wurden in 15 µl SDS 2 x Probenpuffer resuspendiert.

Thermolysin-Stammlösung in Waschpuffer:

1 mg/ml Thermolysin, 10 mM CaCl2 in 1 x Waschpuffer

2.2.5.3 Protoplastierung und transiente Transformation einer Arabidopsis-Mesophyllzellen-Kultur bzw. einer Arabidopsis-Wurzelzellen-Arabidopsis-Mesophyllzellen-Kultur

Die Protoplasten wurden von einer Arabidopsis Landsberg erecta Mesophyllzellen-Kultur (Gabe von Aidyn Mouradov und Csaba Koncz) bzw. einer Arabidopsis Wurzelzellen-Kultur (Gabe von Csaba Koncz) hergestellt und in Anlehnung an das Protokoll von Altmann et al.

(1992) transformiert. Die Protoplasten wurden chemisch mit der PEG-Methode mit 30 µg der jeweiligen Plasmide transformiert und für 24 h inkubiert, bevor sie konfokal analysiert wurden.

2.2.5.3.1 Herstellung der Protoplasten

30-50 ml einer 3-4 Tage alten Zellkultur wurde in ein 50-ml-Gefäß überführt und 5 min bei 60 g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgeschüttet, das Pellet in 35 ml Enzymlösung gründlich resuspendiert, und danach drei Petrischalen mit jeweils 12 ml Protoplasten-Suspension beschickt. Die Petrischalen wurden mit Parafilm verschlossen und mindestens 17 h bei 25° C und 40 bis 50 rpm inkubiert.

Enzymlösung:

1 % (w/v) Cellulase „Onozuka“ R-10 (Serva), 0,25 % Macerocym R-10 (Serva) in 8 mM CaCl2/0.4M Mannitol-Lösung lösen; der pH stellt sich von selber auf etwa 5.5 ein, sonst mit w/KOH auf pH 5.5 bis 5.8; sterilfiltriert

2.2.5.3.2 Aufarbeitung und Reinigung

Die Protoplasten-Suspension wurde in ein 50-ml-Gefäß überführt und für 5 min, 60 g, zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 10 ml W5 einmal gewaschen (5 min, 60 g), wiederum der Überstand verworfen, und das Pellet in 10 ml W5 resuspendiert. Während diese Suspension für mindestens 0.5 bis 2 h auf Eis lagerte, wurden die Protoplasten unter dem Mikroskop kontrolliert.

W5:

150 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM Glucose, pH 5.8 mit w/KOH; sterilfiltriert oder autoklaviert

2.2.5.3.3 Transformation der Protoplasten

Die Protoplasten wurden 5 min bei 60 g abzentrifugiert, und in so viel MaMg aufgenommen, dass die Protoplastenzahl ungefähr 1.6 bis 2 x 10⁷ pro ml betrug. Die Konzentration der in der Transformation verwendeten DNA wurde auf 1 mg/ml eingestellt. Die Transformationsansätze wurden in 15-ml-Gefäße oder Reagenzgläser pipettiert. Im Nachfolgenden ist ein einfacher Transformations-Ansatz beschrieben, der beliebig vervielfacht werden kann: 20-50 µg Plasmid-DNA wurden mit 50 µg carrier DNA (DNA aus Lachs-Sperma; Konzentration 10 mg/ml) vermischt, 300 µl Protoplasten dazu gegeben,

durch leichtes Schütteln durchmischt und 5 min bei 25° C stehen gelassen. Danach wurden 300 µl PEG-CMS-Lösung dazugegeben; dies resultierte in einer PEG-Endkonzentration von 20 %. Nach 30 min bei 25° C wurden die Protoplasten in zwei Schritten gewaschen, um das PEG zu entfernen: 8 ml W5 wurden in 2-ml-Schritten über eine 10-min-Periode unter vorsichtigem Schütteln zu der Suspension gegeben und 5 min bei 60 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 4.5 ml 0.5 M Mannitol + 0.5 ml W5 resuspendiert. Es wurde abermals für 5 min bei 60 g zentrifugiert, das Pellet in 12 ml B5-Medium (+Glucose) aufgenommen und in eine Petrischale überführt. Diese wurde mit Parafilm verschlossen und über Nacht bei 25° C im Dunkeln bis zur Expressions-Analyse stehen gelassen.

MaMg-Lösung (Negrutiu et al., 1978):

15 mM MgCl2, 0.5 M Mannitol, 5 mM MES, mit w/KOH auf pH 5.6, also pro 50 ml: 1.5 ml 0.5 M MgCl2, 4.55 g Mannitol, 48.8 mg MES;

sterilfiltriert oder autoklaviert

PEG-CMS-Lösung:

40 % w/w PEG 6000 (Merck) gelöst in 0.4 M Mannitol, 0.1 M Ca(NO3)2, pH 7-9, sterilfiltriert, 2-ml-Aliquots abgefüllt und bei –20 °C gelagert B5-Medium (+ Glucose):

Gamborgs B5-Medium mit 72.6 g/L Glucose und entsprechenden Hormonen, pH 5.8

2.2.5.4 Transiente Transformation von Epidermiszellen von Arabidopsis-Blättern – particle gun bombardment

Blätter von vier Wochen alten Arabidopsis Col-O-Pflanzen wurden mit der Oberseite nach unten auf MS-Platten gelegt. Für jedes getestete GFP-Konstrukt wurden 300 µg Gold-Partikel (1 µm Durchmesser, Biorad) mit je 10 µg des GFP-Konstruktes und eines 35S-LUC-Konstruktes (pGN35S-luc; Gabe von Dr. Neuhaus-Url) nach Anweisung des Herstellers (Biorad) beschichtet. Die beschichteten Goldpartikel wurden schließlich in 48 µl Ethanol aufgenommen und bis zum Beschießen der Arabidopsis-Blätter auf Eis aufbewahrt. Um die Goldpartikel in die Epidermiszellen der Arabidopsis-Blätter zu schießen, wurde eine „Biolistic PD-1000/He Particle delivery Gun“ (Biorad) mit einem Hepta-Adapter und einem Druck von 900 psi verwendet. Beschossene Proben wurden bei 22° C für 24 h im Dunkeln inkubiert.

Danach wurden die Blätter mit 1 mM Luciferin (in 0.1 % Triton X-100) besprüht, und die Licht-Emission mit einer Hamamatsu HPD:CP CCD-Kamera (Hamamatsu Photonics, Hersching) quantifiziert. Luciferase-exprimierende Blätter wurden für die Konfokale Mikroskop-Analyse auf Objektträger in Wasser eingebettet.

2.2.5.5 Konfokale Mikroskopie (GFP- und Chlorophyll-Visualisierung)

Arabidopsis-Blätter wurden mit einem Leica TCS-4D konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH, Bensheim) und einem 63 x Öl-Immersions-Objektiv untersucht. GFP wurde mit Hilfe eines Argon/Krypton-Lasers mit einer Wellenlänge von 488 nm angeregt; die Fluoreszenz-Emission wurde mit einem Band-Pass-Filter für FITC (green fluorescence, 535/50) detektiert.

Arabidopsis-Protoplasten wurden mit einem Leica TCS SP2 Konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop und einem HCX PL APO 40x/1.25-0.75 Öl CS Objektiv untersucht. Die Mitochondrien wurden durch eine 30minütige Inkubation in Mitotracker-Lösung vitalgefärbt.

GFP und Chlorophyll wurden bei 488 nm angeregt, Mitotracker bei 543 nm; die resultierende Fluoreszenz wurde mit einem Strahlenteiler (TD 488/543/633) und zwei verschiedenen Photomultipliern einer Bandweite von 500-520 nm bzw. 625-720 nm für GFP- bzw.

Chlorophylfluoreszenz oder von 500-520 nm bzw. 565-585 nm für GFP- bzw.

Mitotrackerfluoreszenz, detektiert. Die Bilder wurden mit der zugehörigen Leica Software gespeichert und mit Adobe Photoshop 5.5 weiterverarbeitet.

Mitotracker-Lösung:

5 nM CMTM Ros (Molecular Probes, Leiden, Niederlande), 0.5 M Mannitol, 15 mM NaCl, 12.5 mM CaCl2, 0.5 mM KCl, 0.5 mM Glucose;

pH 5.8