2 Material und Methoden
2.2 Methoden
2.2.3 Klonierungstechniken (in vitro Modifikationen von DNA)
EB-Puffer aufgenommen. Die Konzentrationsbestimmung des DNA-Fragmentes erfolgte wie in 2.2.2.3 beschrieben.
2.2.3.3 Dephosphorylierung linearer DNA-Fragmente
Wenn ein DNA-Fragment in einen Vektor mit identischen sticky ends ligiert werden soll, oder wenn beide blunt ends besitzen, wird der Vektor zunächst alkalisch dephosphoryliert. Dabei werden die 5´Phosphatreste des Vektors entfernt und so eine Selbstligation des Vektors unterbunden. Dazu wurde das Enzym Shrimp Alkaline Phosphatase benutzt.
Zur geschnittenen und isolierten Vektor-DNA wurde 1/10 des Gesamtvolumens des entsprechenden mitgelieferten Dephosphorylierungspuffers und 1 U Phosphatase pro 500 ng DNA gegeben und bis zum Endvolumen mit aqua bidest. aufgefüllt. Die Lösung wurde 1 h bei 37° C inkubiert und die Reaktion durch Hitzeinaktivierung des Enzyms bei 65° C für 20 min abgestoppt.
2.2.3.4 Auffüllen überhängender Enden
Falls Insert und Vektor mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten wurden, können diese blunt end ligiert werden. Dazu müssen die 5´- bzw. 3´-überhängenden Enden der DNA-Stränge mit Nukleotiden aufgefüllt werden.
Es wurden DNA, 10 x Puffer, aqua bidest., dNTPs (je 10 mM) und entweder 1 U Klenow-Polymerase oder 1 U T4 DNA Klenow-Polymerase zusammengegeben und 20 min bei 37° C bzw.
5 min bei RT inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hitzeinaktivierung des Enzyms bei 65° C für 20 min gestoppt. Die Vektoren wurden danach alkalisch dephosphoryliert (Kap. 2.2.3.3)
2.2.3.5 Ligation von DNA-Fragmenten
Bei der Ligation verknüpfen Ligasen eine freie 5´-Phosphat-Gruppe eines Doppelstranges mit der freien 3´-OH-Gruppe eines anderen oder auch des gleichen DNA-Moleküls durch Phosphodiesterbrücken. Im zweiten Fall resultiert das in einer Zirkularisierung der DNA.
2.2.3.5.1 Blunt-end-Ligation
Vektor (etwa 50-100 ng) und Insert wurden im molaren Verhältnis von etwa 1:7 bis 1:10 zusammengegeben und 1 µl T4 DNA-Ligase (30 U/µl) und aqua bidest., 10 x Puffer und PEG nach Angaben des Herstellers der Ligase dazu gegeben. Die Ligation erfolgte für 1 h oder ü. N. im Wasserbad bei 22° C.
2.2.3.5.2 Sticky-end-Ligation
Die Sticky-end-Ligation ist weniger problematisch als die zuvor beschriebene. Das molare Verhältnis von Vektor zu Insert sollte hier bei ungefähr 1:2 liegen. 1 µl T4 DNA-Ligase (5 U/µl) und aqua bidest., 10 x Puffer und PEG wurden nach Angaben des Herstellers zur DNA gegeben. Die Ligation erfolgte für 1 h oder ü. N. im Wasserbad bei 22° C.
2.2.3.6 Herstellung kompetenter E.-coli-Zellen mit der CaCl2-Methode
Um Plasmid-DNA in E.-coli-Zellen einschleusen zu können, müssen die Bakterienzellen vorher „kompetent“, also aufnahmefähig für Plasmid-DNA, gemacht werden. Ist das Plasmid in die Zelle gelangt, so wird es exprimiert. Um eine Selektion der Zellen zu gewährleisten, die das Plasmid tragen, sind in die gängigen Plasmide Antibiotika-Resistenzgene eingebaut.
Wird dem Nährmedium das adäquate Antibiotikum zugesetzt, wird selektiert, und es überleben nur die Zellen mit dem aufgenommenen Plasmid.
500 ml LB-Medium wurden mit einer Vorkultur inokuliert und bei 18° C geschüttelt, bis eine OD600 von 0.5 bis 0.8 erreicht war. Die Zellen wurden auf Eis überführt und danach für 15 min bei 4° C und 3 000 rpm zentrifugiert (Beckmann Kühlzentrifuge, JA 14-Rotor), und das Zellpellet in 200 ml eiskaltem 50 mM CaCl2-Puffer resuspendiert. Nach Inkubation für ca.
30 min auf Eis wurde nochmals wie oben zentrifugiert und die Zellen in 20 ml 50 mM CaCl2 -Puffer vorsichtig resuspendiert. Die Zellen wurden mit 65 % Glycerin zu einer Endkonzentration von 30 % versetzt, bei –70° C tiefgefroren und waren mehrere Wochen verwendbar.
2.2.3.7 Transformation mit Plasmiden
Für die Transformation kompetenter E.-coli-Zellen reichen 10 ng Plasmid-DNA aus. So wurden entweder 3-5 µl eines Ligationsreaktions-Gemisches bzw. 10-50 ng Plasmid-DNA mit 100 µl auf Eis aufgetauten kompetenten Bakterienzellen zusammengegeben. Nachdem 30 min auf Eis inkubiert wurde, wurde für 1 min ein Hitzeschock bei 42° C gegeben und erneut 2 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 900 µl LB-Medium wurde für 1 h horizontal bei 200 rpm und 37° C in einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden nach Transformation eines fertigen Plasmids 50 µl bzw. nach Transformation eines Ligations-Ansatzes die gesamte Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit entsprechendem Antibiotika-Zusatz ausplattiert und über Nacht bei 37° C inkubiert. Zur Kontrolle erfolgten nach jeder Transformation von mehreren Bakterienkolonien Plasmid-Minipräparationen (Kap. 2.2.2.1.1), die dann durch Restriktionsanalyse (Kap. 2.2.3.1) auf das Vorhandensein eines Inserts überprüft wurden. Außerdem wurden Gefrierkulturen angelegt (Kap. 2.2.1.2).
2.2.3.7.1.1 Überprüfung der Transformationseffizienz
Je 1 µl Plasmid-DNA in drei verschiedenen Verdünnungen (1, 10, 100 ng/µl) wurden in je 100 µl kompetente E.-coli-Zellen transformiert. Davon wurden jeweils 10 und 100 µl auf Platten mit dem passenden Antibiotikum ausplattiert und über Nacht bei 37° C inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte die Berechnung der Effizienz nach folgendem Schema:
Volumen Zellsuspension + Volumen Nährmedium x gezählte Kolonienzahl = Koloniengesamtzahl. ausplattiertes Volumen
Die Koloniengesamtzahl lag bei der CaCl2-Methode bei ca. 2 x 107 pro µg DNA.
2.2.3.8 Transformation und Ligation von PCR-Produkten mit dem TOPO TA Cloning Kit und dem pGEM® T-Vector System I Kit
Diese beiden Kits dienten der Ligation eines PCR-Produktes in einen Zwischenvektor. In beiden Kits wird ein T-Vektor, d.h., ein offenes Plasmid mit überhängenden T-Enden, mitgeliefert. So musste ein einzuklonierendes PCR-Produkt, falls dieses nicht durch eine PCR mit Taq-Polymerase entstand, vorher mit Taq-Polymerase behandelt werden (Kap. 2.2.3.10).
Das TOPO TA Cloning Kit basiert auf einer an den Vektor gebundenen Topoisomerase, es muss also keine zusätzliche Ligase zum Reaktionsansatz gegeben werden.
Die Ligation in den pCR- (TOPO Kit) bzw. pGEM-Vektor und die nachfolgende Transformation wurden nach Angaben der Hersteller durchgeführt. Der gesamte Transformations-Ansatz wurde auf LB-Antibiotika-Platten mit einem Zusatz von 4 %0 X-Galactosidase und 100 µM IPTG zur Blau-Weiß-Selektion ausplattiert.
2.2.3.9 Transformation von Synechocystis sp. PCC 6803
Eine Synechocystis-Kultur (OD730 von etwa 0.3) wurde zu einer OD730 von 0.05 bis 0.15 in einem 50 ml Volumen verdünnt und in einem 200-ml-Kolben ü. N. bei 30° C und 170 rpm geschüttelt. Am nächsten Tag wurde die Kultur in ein 50-ml-Röhrchen überführt und 12 min bei 4 500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet so in BG-11 resuspendiert, dass die Kultur eine OD730 von etwa 3.0 – das entspricht einer Zellzahl von etwa 2 x 108/ml – besaß. Nun wurden 300 µl Zellen mit 6 µl Vektor-DNA einer Konzentration von 1-3 mg/ml in einem 2-ml-Reaktionsgefäß vermischt und eine Negativ-Kontrolle mit aqua bidest. angesetzt. Die Ansätze kamen für 3-4 h in ein 30° C warmes Wasserbad und wurden alle 30 min invertiert. Unterdessen wurden sechs zurechtgeschnittene, in aqua bidest.
autoklavierte, Nylon-Membranen luftblasenfrei auf BG-11-Platten ohne Antibiotika ausgelegt.
Nach der Inkubationszeit wurden jeweils 3 x 100 µl der Ansätze auf den Membranen ausplattiert und für 30-60 h in einen klimatisierten 30°-C-Raum gestellt. Danach wurden die Filter auf BG-11-Platten, die die entsprechenden Antibiotika enthielten, transferiert.
Etwa 20-30 der gewachsenen Kolonien der Transformation wurden auf BG-11-Antibiotika-Platten ausgestrichen. Dieser Vorgang wurde, abhängig davon, wie schnell die Kolonien gewachsen waren, etwa alle zwei Wochen wiederholt.
2.2.3.10 Polymerase-Ketten-Reaktion – PCR
Mit Hilfe der von Mullis und Faloona (1987) entwickelten Polymerase-Kettenreaktion (PCR von polymerase chain reaction) können definierte DNA-Sequenzen aus einem komplexen Gemisch von DNA selektiv angereichert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die PCR zum Einbau von synthetischen Restriktionsschnittstellen, dem Nachweis der Mutagenese in Synechocystis und als ein Schritt der Transkriptmengenbestimmung eingesetzt.
Es wurden zwei verschiedene Polymerasen verwendet: die Taq- und die Vent-DNA-Polymerase. Die Taq-Polymerase besitzt keine 3´→5´-Exonuklease-Aktivität. So ist mit diesem Enzym bei der Synthese des neuen DNA-Stranges die Fehlerwahrscheinlichkeit
erhöht. Dennoch wurde sie bei dem Nachweis der Mutagenese und der Transkriptmengenbestimmung eingesetzt, da es hier nicht auf ein fehlerfreies Produkt ankam. Anders, wenn das Produkt kloniert werden sollte. Da die Vent-Polymerase eine 3´→5´-Exonuklease-Aktivität besitzt und damit nahezu fehlerfrei arbeitet, wurde sie für diesen Zweck eingesetzt.
Standard-PCR-Ansätze sahen wie folgt aus:
Volumen für einen Ansatz mit
Komponente Taq-Polymerase Vent-Polymerase
H2O (auf 50 µl) 39.8 µl – x µl 40 µl – x µl
10 x Puffer 5 µl 5 µl
MgCl2 (25 mM) 4 µl /
MgSO4 (100 mM) / 1 µl
dNTPs (je 10 mM) 0.5 µl 1 µl
5´primer (100 pmol/µl) 0.25 µl 0.25 µl 3´primer (100 pmol/µl) 0.25 µl 0.25 µl
Template (1-10 ng/Ansatz) x µl x µl
Taq-Polymerase (+ BSA; 5 U/µl) 0.2 µl /
Vent-Polymerase (2 U/µl) / 0.5 µl
Wurde eine PCR mit Vent-Polymerase durchgeführt, in der das Produkt für weitere Klonierungen verwendet werden sollte, musste im Anschluss eine spezielle Behandlung des PCR-Reaktionsgemisches mit Taq-Polymerase erfolgen, um die für die T-A-Klonierung erforderlichen 3´-dA-Nukleotide an die Produkt-Enden zu hängen. Folgender Ansatz wurde zusammenpipettiert und für 10 min bei 72° C inkubiert:
PCR-Ansatz 50 µl
10 x Puffer 7.5 µl
Taq-Polymerase (5 U/µl) 0.4 µl MgCl2 (25 mM) 6 µl
dATPs (1 mM) 1 µl
BSA (2 mg/ml) 3.75 µl
aqua bidest. 6.35 µl
Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide sind in Kap. 2.1.11 aufgeführt.
2.2.3.10.1 Ganz-Zell-PCR aus Synechocystis-Zellen
Zur einfachen Überprüfung von Transformanden kann eine PCR direkt aus Synechocystis-Zellen durchgeführt werden. Diese Technik hat sich als zuverlässige Vorauswahl richtiger Transformanden erwiesen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Kolonien nicht älter als vier Wochen sind, und es sollte auch nicht zu viel Zellmaterial eingesetzt werden. Eine Kolonie von 2 mm Durchmesser ist völlig ausreichend.
2.2.3.10.2 qRT-PCR (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)
Die RT-PCR wurde in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wurde die cDNA synthetisiert.
Als template dienten 200 ng DNase-verdauter, gereinigte RNA:
template x µl
H2O 12 – x µl
0,1 M DTT 2 µl
5xSuperSript-Puffer 4 µl
dNTPs 1 µl
random primer 0,2 µl (200 ng; entspricht ca. 54 pmol)
RNase-Inhibitor 0,4 µl
SuperScript (200 U/µl) 0,4 µl (80 U)
Der Ansatz wurde 10 min bei 25 °C, 50 min bei 37 °C und abschließenden 95 °C (5 min) inkubiert. Es wurden Verdünnungen hergestellt, die dann als template in einer darauf folgenden PCR eingesetzt wurden.