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93 Herstellung einer TBHP-Lsg. in CH2Cl2
[266]
Wässrige 70 %ige TBHP-Lsg. (60 mL) und abs. CH2Cl2 (70 mL) werden vorsichtig in einem Scheidetrichter vermischt. Nach Phasentrennung wird die organische Phase in einen mit Siedesteinchen bestückten Rundkolben überführt und 8 h unter Rückfluss erhitzt. Währenddessen wird das noch vorhandene H2O (ca. 5 mL) mit Hilfe eines inversen Wasserabscheiders entfernt. Das Erhitzen von Peroxid-haltigen Lösungen sollte nur mit äußerster Vorsicht in einem leistungsstarken Abzug und hinter einem Splitterschutz erfolgen. Die abgekühlte Lösung wird über Nacht in einem Glaskolben, der mit Parafilm verschlossen wird, über 3 Å MS (20 g) im Kühlschrank weiter getrocknet und anschließend in PE-Flaschen über 3 Å MS bei 2 °C gelagert. Der Titer der TBHP-Lsg. (ca. 50 % TBHP/CH2Cl2 v/v, 5-6 M) wird, wie unten stehend beschrieben, mittels iodometrischer Titration bestimmt.
Iodometrische Titration der TBHP-Lsg[266]
Eine 50 mL-Bürette wird mit 50 mL einer 0.1 N Na2SO3-Lsg. befüllt. In einem 250 ml-Erlenmeyerkolben werden 25 mL Isopropanol und 1 mL Essigsäure gemischt und mit 10 mL einer kalten, frisch angesetzten Lösung von NaI (20 g) in Isopropanol (100 mL) versetzt. Nach Zugabe von 0.25 mL der wasserfreien TBHP/CH2Cl2-Lsg. wird die Mischung 30-45 s mit einem Heißluftgebläse bis zum Refluxieren erhitzt. Wird die Lösung nicht erhitzt, wird bei der anschließenden Titration ein zu niedriger Titerwert erhalten. Nach Verdünnung mit 100 mL H2O wird die Lösung schnell mit der 0.1 N Na2SO3-Maßlösung (25-30 mL) bis zum Verschwinden der gelben Färbung titriert. Durch Zugabe von Stärke kurz vor dem Endpunkt kann dieser besser erkannt werden.
Die Konzentration der TBHP-Lsg. berechnet sich wie folgt und sollte 5-6 M betragen:
M (TBHP-Lsg.) = Molarität der dargestellten TBHP-Lsg. [mol L1]
V (TBHP-Lsg.) = eingesetztes Volumen der dargestellten TBHP-Lsg. [mL]
M (Titrant) = Molarität der Na2SO3-Maßlösung [mol L1]
V (Titrant) = verbrauchtes Volumen der Na2SO3-Maßlösung [mL]
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Titration der kommerziell erhältlichen n-BuLi-Lsg.
Eine Mischung aus 300 mg Menthol und einer Spatelspitze 1,10-Phenanthrolin wird in 4 mL abs. THF gelöst und mit der kommerziell erhältlichen n-BuLi-Lsg. titriert. Die Titration ist beendet, wenn ein Farbumschlag von lindgrün nach hellrosa erfolgt. Dabei entspricht der Verbrauch von 3.25 mL Titrant einer Konzentration von 1.6 M. Die exakte Konzentration kann wie folgt aus dem verbrauchten Volumen berechnet werden:
c (n-BuLi) = Konzentration der n-BuLi-Lsg. [mol L1]
V (n-BuLi) = verbrauchtes Volumen der n-BuLi-Lsg. [L]
m (Menthol) = eingewogene Masse an Menthol [g]
M (Menthol) = Molare Masse von Menthol [g mol1]
Chromatographie
Für die präparative säulenchromatographische Trennung wurde als stationäre Phase Kieselgel 60 mit einer Korngröße von 40-63 µm (230-400 mesh) der Firma MACHEREY-NAGEL verwendet.
Zur analytischen Dünnschichtchromatographie wurden Aluminium-Kieselgelkarten 60 mit dem Fluoreszenzindikator F254 der Firma MERCK verwendet. Das verwendete Laufmittel ist bei jedem Versuch explizit angegeben. Die Detektion erfolgte durch Fluoreszenzlöschung mit Hilfe des Fluoreszenzindikators bei einer Wellenlänge von 254 nm und/oder durch Eintauchen in eine der unten aufgeführten Färbereagenzien und anschließendem kurzen Erwärmen mit einem Heißluftgebläse.
Ammoniumheptamolybdat/Cer(IV)sulfat-Reagenz: (NH4)6Mo7O24 ∙ 4H2O (10.0 g), Ce(SO4)2
(0.4 g), konz. H2SO4 (5.4 mL) in H2O (180 mL).
Kaliumpermanganat-Reagenz: KMnO4 (3.0 g), K2CO3 (20.0 g), KOH (0.3 g) in H2O (300 mL).
Ninhydrin-Lsg.: 5 %ig in EtOH.
95 Analytische RP-HPL-Chromatographie
HPLC-Anlage Accela der Firma THERMO SCIENTIFIC (Pumpe: Accela 600; Autosampler: Accela;
Diodenarray-Detektor: Accela PDA; Vorsäule: PHENOMENEX Vydac High Perfomance Protein and Peptide C18; Säule: THERMO SCIENTIFIC Hypersil Gold, Korngröße 3 µm, 2.1 (ID) × 150 mm). Die Detektion erfolgte durch UV-Absorborptionsmessung bei einer Wellenlänge von 254 nm.
Eluent A: H2O/CH3CN/TFA 95:5:0.1 v/v/v.
Eluent B: H2O/CH3CN/TFA 5:95:0.1 v/v/v.
Methode 1:
Flußrate: 1 mL/min
0-3 min 100 % A 0 % B 3-30 min 0 % A 100 % B 30-40 min 100 % A 0 % B
HPLC-Anlage Spectra SYSTEM der Firma THERMO SCIENTIFIC (Controller: SN 4000; Pumpe:
P 4000; Autosampler: AS 100; Diodenarray-Detektor: UV 6000 LP; Vorsäule: PHENOMENEX Vydac High Perfomance Protein and Peptide C18; Säule: PHENOMENEX Jupiter C18, Korngröße 5 µm, 4.6 (ID) × 250 mm). Die Detektion erfolgte durch UV-Absorborptionsmessung bei einer Wellenlänge von 254 nm.
Methode 2: (Eluenten A und B s.o.) Flußrate: 0.7 mL/min
0 min 100 % A 0 % B
0-5 min 0 % A 100 % B 5-6 min 100 % A 0 % B 6-6.5 min 100 % A 0 % B
Chirale analytische HPL-Chromatographie: HPLC-Anlage Accela (s.o).
Säule: DAICEL Chiralpak AD, Korngröße 10 µm, 4.6 (ID) × 250 nm.
Methode 3: Fußrate: 1 mL/min, Hexan/2-Propanol 9:1 v/v.
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Präparative RP-HPL-Chromatographie
Präparative HPLC-Analge LaChrom der Firma MERCK-HITACHI (Controller: D-7000; Pumpe: L7150;
UV-Vis-Detektor: L7420; Säule: PHENOMENEX Jupiter C18, Korngröße 10 µm, 21.2 (ID) × 250 mm).
Die Detektion erfolgte durch UV-Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 254 nm.
Methode 4: (Eluenten A und B s.o.) Flussrate: 7.5 mL/min
0-3 min 80 % A 20 % B 3-20 min 50 % A 50 % B 20-35 min 0 % A 100 % B 35-50 min 0 % A 100 % B 50-55 min 80 % A 20 % B
Methode 5: (Eluenten A und B s.o.) Flussrate: 7.5 mL/min
0-3 min 80 % A 20 % B 3-13 min 0 % A 100 % B 13-35 min 0 % A 100 % B 35-50 min 80 % A 20 % B
HPLC-Anlage SpectraSYSTEM der Firma THERMO SCIENTIFIC (Controller: SN-4000; Pumpe: P4000;
UV-Vis-Detektor: UV1000; Säule: PHENOMENEX Jupiter C18, Korngröße 10 µm, 21.2 (ID) × 250 mm). Die Detektion erfolgte durch UV-Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 254 nm.
Methode 6: (Eluenten A und B s.o.) Flussrate: 7.5 mL/min
0-3 min 70 % A 30 % B 3-20 min 30 % A 70 % B 20-50 min 30 % A 70 % B 50-55 min 70 % A 30 % B
Kernresonanz-Spektroskopie (NMR)
Die Messung der 1H-NMR- und 1H-Breitband-entkoppelten 13C-NMR-Spektren erfolgte an den supraleitenden Multikernresonanzspektrometern Avance III 500, DRX 500 und Avance 600 der Firma BRUKER. Die Aufnahme der Spektren erfolgte standardmäßig bei einer Temperatur von 293 K. Die Spektren wurden anschließend mit dem Programm MESTRENOVA der Firma MESTRELAB
RESEARCH SL bearbeitet. Die chemischen Verschiebungen sind als δ-Werte in ppm relativ zu
97 Tetramethylsilan mit δ = 0.00 ppm angegeben. Das Restprotonensignal des verwendeten deuterierten Lösungsmittels wurde dabei als Referenz verwendet.[267] Die Multiplizitäten werden als s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q (Quartett) und m (Multiplett) bezeichnet. Breiten Signalen wird ein br (engl.:
broad) vorangestellt. Die Kopplungskonstanten J werden in Hertz (Hz) angegeben. Zur vollständigen Zuordnung der einzelnen Signale wurden zusätzlich 2D-Spektren (COSY, HMQC und HMBC) sowie DEPT-135-Spektren aufgenommen.
Die Signalzuordnung bei Spektren der Cryptophycine bzw. der Fragmentbausteine erfolgte in Relation zur Position in der längsten Kette und ggf. fragmentbezogen (Abbildung 39). Die Kohlenstoffatome werden entlang der jeweils längsten Kette aufsteigend vom höchstoxidierten Kohlenstoffatom mit griechischen Kleinbuchstaben versehen (Cα, Cβ, …Cη). Bei den Fragment-C-Analoga wird die Alkylkette des Substituenten gemäß dieser Kennzeichnung benannt. Zur Unterscheidung der verschiedenen Fragmente werden diese mit den Vorsätzen uA, uB, uC und uD gekennzeichnet.
Abbildung 39: Signalzuordnung in der NMR-Spektroskopie am Beispiel von Cryptophycin-52.
Infrarot-Spektroskopie (IR)
Die Messung der IR-Spektren wurde mit Reinsubstanzen an einem Nicolet 380 FT-IR mit ATR-Einheit der Firma Thermo Scientific durchgeführt. Die Messwerte sind als Wellenzahl (ṽ) in cm−1 angegeben. Die relativen Intensitäten der charakteristischen Banden werden wie folgt wiedergegeben: vs (engl.: very strong), s (engl.: strong), m (engl.: medium) und w (engl.: weak), sowie br (engl.: broad).
Fluoreszenzspektroskopie
Zur Aufnahme der Fluoreszenzemissionsspektren wurde ein Lumineszenz Spektrometer LS 50 B der Firma PERKIN ELMER verwendet.
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Massenspektrometrie
EI- und CI-Massenspektren wurden mit dem Magnetsektorfeld-Massenspektrometer Autospec X mit EBE Geometrie der Firma VACUUM GENERATORS gemessen. Das Gerät ist mit einer Standard-EI-bzw. CI-Quelle ausgestattet. Proben werden über eine Schubstange in Aluminiumtiegeln eingeführt.
Die Beschleunigungsspannung beträgt 8 kV im EI-Modus und 6 kV im CI-Modus. Ein Ionenfallen-Massenspektrometer mit Standard-ESI-Quelle vom Typ Esquire 3000 der Firma BRUKER DALTONIK
diente zur Aufnahme der ESI-Massenspektren. Die Proben werden direkt über eine Spritzenpumpe als Lösung in CHCl3/MeOH oder Acetonitril eingeführt. Als Zerstäubungs- und Trockengas dient Stickstoff, als Kollisionsgas für MSn-Experimente wird Helium verwendet. Die Feinmassenbestimmung (HRMS) erfolgte an einem FT-ICR-Massenspektrometer vom Typ APEX III der Firma BRUKER DALTONIK mit externer (Nano-)ESI-Ionenquelle. Als Zerstäubungs- und Trockengas dient auch hier Stickstoff. MALDI-ToF-Massenspektren wurden mit dem Gerät Voyager DE der Firma PE BIOSYSTEMS gemessen (Flugrohrlänge: 1.2 m). Die Messung erfolgt durch Ionisation mittels eines Stickstofflasers (Wellenlänge: 337 nm, Pulsbreite: 3 ns, Wiederholungsrate:
3 Hz) unter Verwendung von 2,4-Dihydroxybenzoesäure als Matrix (Beschleunigungsspannung:
20 kV, Mittelung über 50 Laserschüsse, geräteinterne Standardkalibrierung).
Polarimetrie
Die spezifischen Drehwerte wurden bei Raumtemperatur im angegebenen Lösungsmittel und genannter Konzentration mit einem Digitalpolarimeter vom Typ DIP-360 der Firma JASCO bestimmt.
Die Messungen wurden bei einer Wellenlänge von 589 nm (Natrium-D-Line und Monochromator) durchgeführt. Der spezifische Drehwert lässt sich anhand der folgenden Formel aus dem arithmetischen Mittel von 10 Messungen ermitteln:
[ ] [ ] = spezifischer Drehwert [10-1 deg cm2 g-1]
α = arithmetisches Mittel der gemessenen Drehwerte [deg]
l = Küvettenlänge [dm]
c = Konzentration der Probenlsg. [g 100 mL1]
Potentiometrie
Zur Bestimmung des pH-Wertes wurde das pH-Meter MP 220 mit der pH-Elektrode Inlab 420 genutzt. Beide Geräte entstammen der Firma METTLER TOLEDO.
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