1. Versuchsaufbau
Bei dem durchgeführten Versuch handelt es sich um eine pharmakokinetische Studie an insgesamt zwölf Pferden. Nach Applikation von zwei verschiedenen Dexamethasonpräparaten an je sechs Pferden wurden Blut- und Urinproben dieser Pferde gewonnen. Anschließend wurden diese Proben im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln aufgearbeitet.
1.1. Testsubstanzen
In der Studie wurden die Substanzen Voren® Suspension und Voren®-Depot der Firma Boehringer Ingelheim verwendet.
Voren® Suspension : Wirkstoff : Dexamethason-21-isonicotinat (1 mg/ml)
Bestandteile: 1,35 mg Methyl (4-hydroxybenzoat) 0,15 mg Propyl (4-hydroxybenzoat) Natriumchlorid
Polysorbat 80
Wasser für Injektionszwecke
Chargennummer: S20564
Voren®-Depot : Wirkstoff : Dexamethason-21-isonicotinat (3 mg/ml)
Bestandteile: 1,35 mg Methyl (4-hydroxybenzoat) 0,15 mg Propyl (4-hydroxybenzoat) Natriumchlorid
Polysorbat 80
Wasser für Injektionszwecke
Material und Methoden Chargennummer: S20605
Beide Präparate wurden in dieser durchgeführten Arbeit einmalig und in der vom Hersteller empfohlenen Dosierung eingesetzt.
1.2. Versuchstiere
Die Versuchspferde wurden vom Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Mariensee gehalten und untergebracht. Als Stall diente ein großer Boxenlaufstall mit einzelnen Futterplätzen. Über Tag bewegten sich die Pferde auf einem angrenzenden Paddock, über Nacht hatten sie Auslauf auf einer Weide. Die Fütterung bestand aus Grassilage bzw. Gras, jeweils zur freien Verfügung. Wasser stand in Form einer Selbsttränke ebenfalls ad libitum zur Verfügung.
Die Tiere bildeten eine homogene Gruppe von Wallachen (zehn Wallache der Rasse Warmblut, zwei Wallache der Rasse Englisches Vollblut) im Alter von sechs bis elf Jahren.
Alter, Geschlecht und Rasse der Tiere sind Tabelle 2 zu entnehmen.
Pferd [Nr.]
Alter [Jahre]
Geschlecht Rasse
1 9 Wallach Warmblut
2 9 Wallach Warmblut
3 9 Wallach Warmblut
4 9 Wallach Vollblut
5 10 Wallach Warmblut
6 6 Wallach Vollblut
7 10 Wallach Warmblut
8 11 Wallach Warmblut
9 8 Wallach Warmblut
10 10 Wallach Warmblut
11 9 Wallach Warmblut
12 9 Wallach Warmblut
Tabelle 2: Alter, Geschlecht und Rasse der Versuchspferde
Zu Versuchsbeginn sowie während des gesamten Versuchsablaufes erwiesen sich alle Tiere als klinisch gesund. Die Nierengesundheit der Pferde wurde mittels Überprüfung der Kreatininkonzentrationen im Plasma gezeigt. In den Tabellen 29-40 im Anhang sind die ermittelten Kreatininwerte jedes einzelnen Pferdes aufgeführt.
Material und Methoden 1.3. Versuchsablauf
Der praktische Teil der Studie, die Phase der Probenentnahme, gliederte sich in einen Vorversuch und einen anschließenden Hauptversuch.
1.3.1. Vorversuch
Der pro Testsubstanz an einem Pferd pro Tiergruppe (Pferd 5 und Pferd 12) durchgeführte Vorversuch diente zur Abschätzung der zu erwartenden Dexamethasonkonzentrationen in den gewonnenen Blut- und Urinproben, zur Überprüfung des Probenentnahmeschemas, sowie zur Entwicklung eines geeigneten Analyseverfahrens für Dexamethason. Der Versuchsaufbau ist in Kapitel III.1.3.2. näher beschrieben.
1.3.2. Hauptversuch
In diesen Teil des Versuchs waren alle zwölf Versuchspferde beteiligt. Die Gruppe wurde geteilt. Sechs der Pferde dienten der Untersuchung von Voren® Suspension, die anderen sechs der von Voren®-Depot.
Direkt vor Beginn dieser Versuchsphase wurden alle Pferde mit Hilfe einer digitalen Viehwaage gewogen, um die Dosierung der Präparate genau auf das Körpergewicht der einzelnen Tiere abstimmen zu können. Die Dosierung von Voren® Suspension betrug 0,02 mg/kg Körpergewicht Dexamethason-21-isonicotinat, was einer Arzneimittelmenge von 2 ml pro 100 kg Körpergewicht entspricht. Voren® Suspension wurde den sechs Pferden der ersten Gruppe einmalig intravenös verabreicht. Voren®-Depot wurde in einer Konzentration von 0,06 mg/kg Körpergewicht Dexamethason-21-isonicotinat dosiert, was ebenfalls einer Arzneimittelmenge von 2 ml pro 100 kg Körpergewicht entspricht. Voren®-Depot wurde den sechs Pferden der zweiten Gruppe einmalig intramuskulär appliziert.
Umgerechnet auf das Körpergewicht ergeben sich für die eingesetzten Pferde die den nachfolgenden Tabellen 3 und 4 zu entnehmenden Arzneimittelmengen:
Material und Methoden
Tabelle 3: Gewicht der Versuchspferde der Gruppe 1 und verabreichte Menge an Voren®
Suspension (Dosierung: 0,02 mg/kg Körpergewicht)
Pferd
Tabelle 4: Gewicht der Versuchspferde der Gruppe 2 und verabreichte Menge an Voren®-Depot (Dosierung: 0,06 mg/kg Körpergewicht)
Eine halbe Stunde vor Applikation der Testsubstanz wurde von allen Pferden eine Urinprobe gewonnen, welche als Leer–Urinprobe diente. Auch wurde eine Leer–Blutprobe pro Pferd entnommen, nachdem bei jedem Pferd ein Venenverweilkather gelegt wurde. Der Katheter (Vygonüle S®) wurde jedem Pferd nach vorheriger Rasur und Desinfektion der betreffenden Stelle in die Vena jugularis sinister gelegt und dort mit nicht resorbierbarem Faden (Filovet Bengen®) fixiert.
Voren® Suspension wurde den sechs Tieren der ersten Gruppe verabreicht, indem jedem dieser Pferde ein Verweilkatheter nach dem oben bereits beschriebenen Verfahren in die Vena jugularis dextra gelegt wurde. Durch diesen Katheter wurde die jeweils errechnete Arzneimittelmenge mittels Einmalspritzen streng intravenös appliziert. Die Spritze wurde nach der Applikation dreimal durch Aspiration von Vollblut gespült, um Medikamentenreste in der Spritze zu vermeiden. Direkt nach der Applikation wurde der Katheter wieder entfernt und die Einstichstelle mit einer antiseptischen Salbe (Vet-Sept Salbe®) behandelt.
Die Applikation von Voren®-Depot erfolgte bei den sechs Tieren der zweiten Gruppe, nach vorheriger Desinfektion der Einstichstelle, intramuskulär in die lange Sitzbeinmuskulatur der linken Hintergliedmaße. Zu diesem Zweck wurden Einmalkanülen und -spritzen verwendet.
Material und Methoden
Vor Injektion der berechneten Stoffmenge aus den Einmalspritzen wurde im Gewebe asperiert, um zu gewährleisten, dass kein Gefäß beim Einstich getroffen wurde. Nach vollzogener Applikation der Präparate wurde nun in festgelegten Zeitabständen, wie sie Tabelle 5 zeigen, Blut– und Urinproben entnommen. Die Proben wurden reproduzierbar zur gleichen Tageszeit entnommen, um eine Vergleichbarkeit der Probenergebnisse zu gewährleisten.
Die Blutproben wurden in vier, jeweils 9 ml fassenden, mit Lithium–Heparin beschichteten Monovetten® (Sarstedt) aufgefangen. Zwölf Stunden nach Versuchsbeginn wurden die Verweilkatheter in der linken Jugularvene entfernt und an der Einstichstelle ebenfalls mit antiseptischer Salbe (Vet-Sept Salbe®) behandelt. Die weiteren Blutproben wurden durch Punktion der Vena jugularis mittels einer Einmalkanüle entnommen.
Die Pferde waren darauf konditioniert, bei Betreten des mit Stroh eingestreuten Laufstalles Urin abzusetzen. Die Urinproben wurden in Form von Spontanharnproben gewonnen und mit Hilfe eines Hartplastikbechers, in welchen ein Einmalplastikbecher eingesetzt wurde, aufgefangen. Der Hartplastikbecher war am Ende eines ca. 50 cm langen Stabes befestigt.
Material und Methoden
Voren®-Depot Voren® Suspension
Blut Urin Blut Urin Tabelle 5: Entnahmezeitpunkte von Blut– und Urinproben im Hauptversuch
1.4. Probenaufbereitung und Probenlagerung
Das zum jeweiligen Entnahmezeitpunkt mit Monovetten® entnommene Vollblut wurde direkt zentrifugiert (1000 Umdrehungen pro Minute, 15 Minuten). Anschließend wurde das den Überstand der jeweiligen Probe darstellende Plasma mittels steriler Einmalkanülen und 20 ml Einmalspritzen in ein 16 ml fassendes Glasgefäß mit Kunststoffschraubdeckel überführt. Pro Probe wurden weiterhin jeweils drei Eppendorfgefässe mit je 1,5 ml Plasma befüllt. Die Plasmaproben wurden bis zur Aufarbeitung bei -20 °C gelagert.
Die in Einwegplastikbechern aufgefangenen Urinproben wurden umgehend in jeweils einen 100 ml fassenden Urinbecher aus Kunststoff mit Schraubverschluss umgefüllt. Bis zur Analyse wurden diese Proben bei ebenfalls -20 °C aufbewahrt.
Material und Methoden
2. Aufarbeitung der Plasma- und Urinproben
Die bei -20 °C gelagerten Blut– und Urinproben des Vorversuchs wurden mit den in Kapitel III.5.1. und III.5.2. beschriebenen Analysemethoden im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln aufgearbeitet. Die gemessenen Dexamethasonkonzentrationen dienten zur Abschätzung der Anreicherung sowie Abflutung von Dexamethason in Blut und Urin. Auf diese Konzentrationsbereiche bezogen wurden die Analysemethoden abgestimmt und validiert, um den gesamten ermittelten Konzentrationsbereich in Blut und Urin abdecken zu können.
3. Methodenentwicklung
Diese Versuchsphase diente dem Ziel, eine geeignete Analysemethode einschließlich Aufarbeitung der gesammelten Blut– und Urinproben zum Nachweis von Dexamethason zu entwickeln.
3.1. Chemikalien
Die zur Analyse der Blut– und Urinproben benötigten Gegenstände und Chemikalien standen im Institut für Biochemie der Sporthochschule in Köln zur Verfügung oder wurden durch dieses bereitgestellt.
Tabelle 6 sind die Chemikalien sowie der jeweilige Hersteller zu entnehmen.
Material und Methoden
Chemikalie Herstellung durch:
Acetronitril J.T.Baker, Deventer, Holland
Ammoniumacetat Merck KGaA, Darmstadt Bidestilliertes Wasser (Milli-Q-Wasser) Institut für Biochemie, Köln
ß-Glucuronidase von Escherichia coli Roche Diagnostics GmbH,
Institut für Biochemie, Köln Dexamethason Firma Sigma
Dexamethason-21-isonicotinat Pharmakologie, Tierärztliche Hochschule Hannover
Essigsäure (100 %) Merck KGaA, Darmstadt Fluocortolon-Stammlösung (1000 µg/ml) Institut für Biochemie, Köln
Kalilauge (10 N) Institut für Biochemie, Köln tertiär Butylmethylether (TBME), vor
Gebrauch destilliert
KMF Laborchemie GmbH, Lohmar
Tabelle 6: verwendete Chemikalien
3.2. Herstellung von Standardlösungen
Zur Quantifizierung des Dexamethasongehaltes wird gegen einen Referenzstandard verglichen. Zur Herstellung des Dexamethasonstandards wurden 10 mg Dexamethason (Firma Sigma) in einen 10 ml fassenden Erlenmeyerkolben eingewogen und dieser bis zur Markierung des Kolbens mit destilliertem Methanol aufgefüllt. Der Inhalt wurde gut durchmischt. Der so entstandene Referenzstandard hatte eine Konzentration von 1 mg/ml.
Aus dieser Lösung wurden durch anschließende Verdünnungsschritte mit wiederum Methanol weitere Dexamethasonstandards mit den Konzentrationen 10 µg/ml, 1 µg/ml, 0,1µg/ml und
Material und Methoden
0,01 µg/ml hergestellt. Die Referenzstandards wurden über den gesamten Zeitraum der Probenaufarbeitung bei -20 °C aufbewahrt.
3.3. Wahl und Herstellung des internen Standards
Aufgrund seiner großen strukturellen Ähnlichkeit, seiner Stoffgruppenzugehörigkeit, seines chemischen Verhaltens und seiner reproduzierbaren Ergebnisse in wiederholten Kalibrierungen im Vergleich zum Dexamethason wurde Fluocortolon (6α-Fluoro-16α-methyl-1-dehydrocorticosteron) als interner Standard gewählt.
Zur Herstellung des internen Standards wurden 10 µl einer 1000 µg/ml Fluocortolon-Stammlösung in einen 10 ml fassenden Erlenmeyerkolben vorgelegt und bis zur Markierung des Kolbens mit destilliertem Methanol aufgefüllt, und der Inhalt durchmischt. Der entstandene Standard hatte eine Konzentration an Fluocortolon von 1 µg/ml.
Dem internen Standard, welcher den aufzuarbeitenden Urinproben zugesetzt wurde, wurde, bei gleicher Fluocortolonkonzentration, zusätzlich noch 250 µl einer 1000 µg/ml D5-Androsteron-glucuronid-Lösung zusetzt. Diese sollte als Hydrolysemarker dienen. Ein Hydrolysemarker zeigt als Indikator die Vollständigkeit einer abgelaufenen Hydrolyse. In dieser Studie wurden mittels Hydrolyse die an Dexamethason gebundenen Glucuronide abgespalten und die Gesamtfraktion an Dexamethason frei. Die Vollständigkeit dieser abgelaufenen Hydrolyse wurde, wie in Kapitel IV.3. gezeigt, durch das eingesetzte D5-Androsteron-glucuronid-Lösung überprüft. Die internen Standards wurden ebenfalls bei -20
°C gelagert.
3.4. Entwicklung der angewandten Methoden
Im Rahmen der Routinediagnostik besteht im Institut für Biochemie der Sporthochschule in Köln eine Analysemethode zum Nachweis von Glucocorticosteroiden im Pferdeplasma und – urin. Diese Methode wurde auf die Detektion von Dexamethason abgestimmt.
Die Leer-Plasmaproben und die Leer-Urinproben wurden jeweils mit einer vorher festgelegten Menge Dexamethason sowie einer definierten Menge internem Standard versetzt, so dass Kalibrationsreihen beider Matrices entstanden. Diese wurden nach den bestehenden Analysemethoden aufgearbeitet und anschließend mit der in Kapitel III.3.5. beschriebenen Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)-Methode gemessen.
Material und Methoden
Die gemessenen Dexamethasonkonzentrationen lagen im Blut jedoch deutlich unter den zuvor zugegebenen Dexamethasonkonzentrationen. Aufgrund dieser Konzentrationsunterschiede mussten Veränderungen an der Methode vorgenommen werden. Die eingesetzte Plasmamenge sowie die Menge des zum Anlösen der bearbeiten Plasmaprobe verwendeten Methanols wurden verdoppelt. Die eingesetzte Urinmenge blieb gleich. Jedoch wurde bei der Aufarbeitung der Urinproben die Menge des Extraktionsmittels (tertiär Butylmethylether) um 1 ml verringert.
3.5. Chromatographie/HPLC
Zur Probenmessung wurde die nachfolgend beschriebene Kombination eines Hochleistungs-Flüssigchromatographen und eines Massenspektrometers (HPLC/MS/MS) genutzt.
HPLC:
Gerät: HP Series 1100 Liquid Chromatograph (Waldbronn, Germany) Säule: Merck LiChroCART®RP 18 endcapped 55x4 mm
Eluent: A: H2O, 4 mmol Ammoniumacetat /l, 0,1 ml Essigsäure (100 %)/l; ph: 3,5 B: Acetonitril
Gradient:
Tabelle 7: Gradientenbedingungen
Injektionsvolumen: 20 µl Run Time: 9 min
Post Time: 3, 5 min
Schritt Zeit [min] Flussrate [µl/min] Eluent A(%) Eluent B(%)
1 0,10 500 90 10
2 8,00 500 10 90
3 9,00 500 10 90
4 9,01 500 90 10
5 12,51 500 90 10
Material und Methoden Massenspektrometer:
Gerät: Perkin Elmer Sciex API 2000 Triple-Quadrupol-Massenspekrometer (Foster City, California, USA)
Interface Temperature: 475°C Ionenquelle: APCI
Ionisationseinstellung: positiv Aquisitionseinstellung: MRM
Kollisionsgas: Stickstoff (N2), 2,0 x 10E-5 torr Kollisionsenergie: optimiert für jedes Ionenprodukt
3.6. Hydrolyseversuche Urin
Um in den Urinproben die Gesamtmenge an Dexamethason, d.h. sowohl das frei vorliegende Dexamethason als auch den glucuronidiert vorliegenden Anteil an Dexamethason zu erfassen, wurden der eigentlichen Analysemethode versuchsweise verschiedene Hydrolysen vorgeschaltet. Dazu wurden Urinproben mit einer vorher ermittelten Dexamethasonkonzentration verwendet.
Da wenige Erfahrungswerte vorlagen, welche Form der Hydrolyse zu diesem Zweck am effektivsten ist, wurden drei Hydrolysearten getestet.
1) Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli
Es wurden 5 ml der zu untersuchenden Urinprobe mit 50 µl internem Standard versetzt.
Durch Zugabe von 1,5 ml Phosphat-Puffer (0,8 mol/l) wurde der Urin auf einen ph-Wert von 7 eingestellt. Es folgte die Zugabe von 70 µl ß-Glucuronidase von Escherichia coli und anschließende Inkubation für eine Stunde bei 50 °C im Wasserbad. Nach Ablauf der vorgesehenen Inkubationszeit wurden die Proben nach der in Kapitel III.5.2. beschriebenen Analysemethode aufgearbeitet.
2) Hydrolyse mit ß-Glucuronidase /Arylsulfatase von Helix pomatia
Es wurden wiederum 5 ml der zu untersuchenden Urinprobe mit 50 µl internem Standard versetzt. Durch Zugabe von 0,4 ml Natrium-Acetat-Puffer (4 mol/l) wurde der Urin auf einen
Material und Methoden
ph-Wert von 5,2 eingestellt. Es folgte die Zugabe von 50 µl ß-Glucuronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia und anschließende Inkubation für zwei Stunden bei 50 °C im Wasserbad.
Nach Ablauf der vorgesehenen Inkubationszeit wurden die Proben nach der in Kapitel III.5.2.
beschriebenen Analysemethode aufgearbeitet.
3) Saure Hydrolyse
Nochmals wurden 5 ml der zu untersuchenden Urinprobe mit 50 µl internem Standard versetzt. Es folgte die Zugabe von 0,5 ml Salzsäure (10 N) und ca. 100 mg L-Cystein. Nach Ablauf der vorgesehenen Inkubationszeit von einer Stunde bei 100 °C im Heizblock wurden 0,5 ml Kalilauge (10 N) zugegeben. Anschließend wurden die Proben nach der in Kapitel III.5.2. beschriebenen Analysemethode aufgearbeitet.
Die Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli und ß-Glucuronidase von Helix pomatia erwiesen sich beide als effektiv. Die zuvor ermittelten Dexamethasonkonzentrationen der Proben wurden überschritten. Die saure Hydrolyse erbrachte einen geringen Anstieg der Dexamethasonkonzentration und wurde somit bei weiteren Hydrolyseversuchen außer Acht gelassen.
In einem weiteren Schritt wurde die Hydrolysedauer verlängert. Die Hydrolysen mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli bzw. Helix pomatia wurden wiederholt und die Probenansätze bei 37 °C über Nacht für 14 Stunden im Wasserbad inkubiert. In beiden Fällen wurde eine Erhöhung der Dexamethasonausbeute von 200 % bis knapp 300 % erzielt. In den Probenansätzen der Hydrolyse mit Helix pomatia schwankte der Hydrolysemarker sehr stark, obwohl dieser nach abgelaufener und anzunehmend vollständiger Hydrolyse reproduzierbar gleich bleiben sollte. Dieses Kriterium wurde in den Probenansätzen der Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli besser erfüllt.
Anhand dieser Erkenntnisse wurde die Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli als Hydrolyse der Wahl festgelegt.
3.7. Bewertung der Methodenentwicklung
Mit den Erkenntnissen aus den Vorarbeiten zur Methodenentwicklung konnte gezeigt werden, dass die Methoden eine eindeutige und reproduzierbare Darstellung der zu untersuchenden
Material und Methoden
Substanzen im Chromatogramm erbrachten. Sie wurden als geeignet angesehen, so dass sie zur Aufarbeitung der Vorversuchsproben sowie der Hauptversuchsproben verwendet wurden.
Weiterhin konnte eine Entscheidung bezüglich der Entnahmezeiten der Blut– und Urinproben getroffen werden. Da Dexamethason in den letzten entnommenen Proben des Vorversuchs noch deutlich nachzuweisen war, wurde der Probenentnahmezeitraum des nachfolgenden Hauptversuches für Blut bei Voren® Suspension um acht Tage, bei Voren®-Depot um neun Tage verlängert. Der Entnahmezeitraum für die Urinproben verlängerte sich bei Voren®
Suspension um dreizehn Tage, bei Voren®-Depot um wiederum neun Tage.
4. Methodenvalidierung
Vor Aufarbeitung und Messung der Hauptversuchsproben sollte mittels Methodenvalidierung gezeigt werden, dass die entwickelten Analysemethoden geeignet waren, und sowohl sichere als auch reproduzierbare pharmakokinetische Daten für den Wirkstoff Dexamethason lieferten. Für die Validierung wurden Leer-Plasma- und Leer-Urinproben sowie tagesaktuelle Kalibrationskurven mit mindestens fünf Kalibrationspunkten nach den in Kapitel III.5.1. und III.5.2. beschriebenen Analysemethoden aufgearbeitet.
Die nachfolgend beschriebenen Kriterien galten in dieser Studie als Validierungsparameter.
4.1. Selektivität
Selektivität ist die Fähigkeit einer Methode, verschiedene nebeneinander vorliegende und zu bestimmende Komponenten ohne gegenseitige Störung zu erfassen und sie somit eindeutig zu identifizieren (KROMIDAS, 1999). Man versteht darunter auch das Maß für die Güte der Trenntechnik einer HPLC–Methode. Sie ist gekennzeichnet durch eine ausreichende Trennung der zu analysierenden Substanz von allen denkbaren Störsubstanzen inklusive der Matrix, was sich im Chromatogramm anhand der unterschiedlichen Retentionszeiten der Peaks darstellt.
Um die Selektivität der gewählten HPLC-Methode abzusichern, wurden Leer–Plasmaproben und Leer-Urinproben von sechs Pferden an den in Tabelle 8 aufgezeigten Kalibrationspunkten aufgearbeitet und analysiert.
Material und Methoden
Leer-Matrix Konzentrationspunkte der
Kalibrationskurve [ng/ml]
Plasma 0,1 / 0,25 / 0,5 / 1 / 1,5 / 2 / 5 Urin 0,5 / 1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 / 20 / 50
Tabelle 8: Dexamethasonkonzentrationen an den einzelnen Kalibrationspunkten zur Bestimmung der Selektivität
4.2. Linearität
Mit dem Begriff der Linearität wird in der Analytik die Korrelation zwischen Signal des Detektors und Konzentration des Analyten verbunden. Diese Korrelation wird durch eine Kalibrierfunktion, die sich als eine Gerade darstellen sollte, beschrieben. Linearität ist somit die Fähigkeit einer Methode, innerhalb eines gegebenen Konzentrationsbereiches Ergebnisse zu liefern, die der Konzentration des Analyten direkt proportional sind (KROMIDAS, 1999).
Die Überprüfung der Linearität erfolgte an sechs Leermatrixproben für Plasma und Urin.
Diese wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des Analyten versetzt und zwar so, dass sie den gesamten Messbereich abdeckten, äquidistant waren und aus zwei Wiederholungen eines jeden Messpunktes bestanden (DIN 38402, 1986). Messpunkte unterhalb der Nachweisgrenze und Leermatrixwerte dürfen nicht zu der Kalibrationskurve hinzugerechnet werden (DIN 32645, 1994). Die nach diesen Kriterien dotierten Leermatrixproben der Kalibrationsreihe wurden an drei aufeinander folgenden Tagen jeweils aufgearbeitet und gemessen.
Die Kalibrationspunkte wurden wie folgt festgelegt (Tabelle 9):
Leer-Matrix Konzentrationspunkte der
Kalibrationskurve [ng/ml]
Plasma 0,1 / 0,25 / 0,5 / 1 / 1,5 / 2 / 3 / 4 Urin 0,5 / 1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 /15 / 20 / 25
Tabelle 9: Dexamethasonkonzentrationen an den einzelnen Kalibrationspunkten zur Bestimmung der Linearität
Die nach der chromatographischen Messung erhaltenen Rohdaten werden gegen die Konzentration der einzelnen Kalibrationspunkte aufgetragen, graphisch dargestellt und standardmäßig visuell auf Ausreißer und Linearität untersucht.
Material und Methoden 4.3. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze
Die Nachweisgrenze (= Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) ist die niedrigste Konzentration eines Analyten, bei der das Messignal ein vom Leerwert unterscheidbares Instrumentensignal liefert.
In dieser Studie erfolgte die Bestimmung der Nachweisgrenze anhand der Kalibrierkurvenmethode, einer indirekten Methode nach DIN 32645 (1994). Hierbei wird zunächst aus den Residuen der linearen Regression die Reststandardabweichung sxo aus der Summe der Abweichungsquadrate Qx der Freiheitsgraden der linearen Kalibration f errechnet.
sxo = f Qx
sxo = Reststandardabweichung
Qx = Summe der Abweichungsquadrate f = Freiheitsgrade der linearen Kalibration
Mittels dieser Standardabweichung sxo und dem errechneten Mittelwert X aller Kalibrationskonzentrationen wird dann das Konfidenzintervall (Vertrauensbereich, VB) für den Merkmalswert Null (VB0) errechnet, wobei eine t-Verteilung für eine vorgesehene Fehlerwahrscheinlichkeit α angenommen wird.
VB0 = sxo · t f, α · 1+ ² +1 Qx
X n
VB0 = Vertrauensbereich (Konfidenzinterval) für den Merkmalswert Null sxo = Reststandardabweichung
t f, a = ein vorgegebener Tabellenwert
X = Mittelwert
Qx = Summe der Abweichungsquadrate n = Anzahl der Proben
Der Term t f, a ist ein vorgegebener Tabellenwert oder kann alternativ mit Hilfe der unten aufgeführten Formel berechnet werden:
Material und Methoden t f, α = TINV (α; f )
TINV (α; f ) = t-Wert der t-Verteilung unter den Bedingungen des Freiheitsgrades (f) sowie der Fehlerwahrscheinlichkeit (α)
Über die Steigung α der linearen Regressionsgeraden kann die Nachweisgrenze (NG) mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α folgendermaßen errechnet werden:
NG = αο VB
NG = Nachweisgrenze
VB0 = Vertrauensbereich (Konfidenzinterval) für den Merkmalswert Null a = Fehlerwahrscheinlichkeit
Nach DIN 32645 (1994) beschreibt die Bestimmungsgrenze die kleinste quantifizierbare Menge eines Analyten und wird somit auch als Quantifizierungsgrenze (= limit of
quantification, LOQ) bezeichnet. Es ist die Menge des Analyten, die mit einer vorgegeben Richtigkeit und Präzision quantitativ erfasst werden kann. Dieser Punkt entspricht dem niedrigsten Kalibrationspunkt bei einer Reproduzierbarkeit von ≤ 20 % und einer
Messgenauigkeit von 100 ± 20 % für diesen Punkt. Der relative Fehler ist kleiner oder gleich 20 % (EHSLC, 2002).
Zur Bestimmung der Quantifizierungsgrenze wurden fünf Proben aus dem gewünschten Kalibrationsbereich an drei aufeinander folgenden Tagen aufgearbeitet und chromatographisch gemessen.
4.4. Richtigkeit
Die Richtigkeit ist das Maß der Übereinstimmung zwischen einem ermittelten und einem erwarteten Referenzwert. Man bezieht sich demnach auf diesen Referenzwert, der als fehlerfrei und richtig gilt.
In dieser Studie wurde die Richtigkeit überprüft, indem jeweils fünf Leer-Matrixproben für Plasma und Urin mit einer niedrigen (low qualitiy control standard, LQC), einer mittleren (midrange quality control standard, MQC) und einer hohen (high quality control standard,
Material und Methoden
HQC) Kalibrationskonzentration des zu analysierenden Stoffes dotiert wurden. Anschließend wurden die Probenansätze an drei aufeinander folgenden Tagen aufgearbeitet und chromatographisch gemessen (EHSLC, 2002). Die ermittelten Ergebnisse sollten für den mittleren und den hohen Kalibrationspunkt nicht mehr als 15 %, für den niedrigsten Kalibrationspunkt nicht mehr als 20 % vom Referenzwert abweichen.
Die relative Abweichung wird auch als relativer Fehler (RE) bezeichnet.
Um die relative Abweichung des ermittelten vom erwarteten Referenzwert zu bestimmen, werden die mittlere berechnete Konzentration (A) und die theoretische Konzentration (B) nach folgender Formel in Beziehung gesetzt:
RE % = [(A-B)/B·x·100)]
4.5. Präzision
Die Präzision ist das Maß für die Übereinstimmung unabhängiger Analysenergebnisse untereinander oder einfach ausgedrückt das Maß für die Streuung von Analysenergebnissen.
Als Streuungsmaß, und damit als Präzisionsmaß, wird die Standardabweichung s verwendet.
Weiterhin unterscheidet man die Wiederholpräzision sw (= intraday reproducibility oder Tagespräzision) von der Zwischenpräzision sb (= interday reproducibility).
Die Wiederholpräzision beschreibt die Präzision der Tagesserien, somit eine Aufarbeitung
Die Wiederholpräzision beschreibt die Präzision der Tagesserien, somit eine Aufarbeitung