Biochemischer Nachweis von arretierten Replikationsgabeln
Nachweis von Doppelstrangbrüchen
Die durch jáÅÜÉä et al. gezeigten Daten deuten darauf hin, daß arretierte Replikations-gabeln über das Auftreten von Doppelstrangbrüchen nachgewiesen werden können (jáÅÜÉä et al., NVVT). Diese Hypothese stützt sich hauptsächlich auf folgende Befunde:
Durch ròÉëí et al. wurde gezeigt, daß rep recBC-Mutanten nicht lebensfähig sind.
Zusammen mit weiteren Daten wurde hieraus die Hypothese abgeleitet, daß es in rep-Mutanten häufiger zu einem Arrest der Replikation kommt. Im Zuge eines solchen Arrestes entstehen doppelsträngige DNA-Enden, welche entweder degradiert, oder durch homologe Rekombination prozessiert werden müssen (ròÉëí et al., NVVR). Diese Hypo-these konnte durch die Befunde gestützt werden, nach denen es in rep recBts recCts -Mutanten bei nichtpermissiver Temperatur zu einer Akkumulation von Doppelstrang-brüchen kommt (jáÅÜÉä et al., NVVT). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß eine ektopische ter-site (siehe auch Seite 19) im Chromosom von E. coli vermehrt zur Bildung von Doppelstrangbrüchen führt (_áÇåÉåâç et al., OMMO). Diese Daten untermauern die Hypothese, daß durch stabile DNA-Protein-Komplexe, welche zu einem Arrest der Repli-kation führen, vermehrt Doppelstrangbrüche entstehen.
Problematisch an diesem experimentellen System ist, daß für den Nachweis von Doppelstrangbrüchen in E. coli artifizielle Bedingungen geschaffen werden müssen, indem z. B. Proteine der homologen Rekombination ausgeschaltet werden und dann die Menge auftretender Doppelstrangbrüche nach der Deletion zusätzlicher Gene (wie z. B.
rep) bestimmt wird. Es ist nicht ohne weiteres möglich, direkt den Einfluß bestimmter Mutationen in einem ansonsten Wildtyphintergrund zu untersuchen.
Nachweis von Holliday junctions
Neben dem Nachweis auftretender Doppelstrangbrüche, welche u. a. durch die Auflösung von Holliday junctions durch Resolvasen entstehen, ist es ebenfalls möglich, Holliday junctions, die gemäß dem in der Einleitung dargelegten Modell (siehe Seite NT) als Inter-mediat auftreten, direkt nachzuweisen. Dies ist z. B. durch 2D-Gelelektrophorese möglich.
In Saccharomyces cerevisiae konnte durch dieses Verfahren gezeigt werden, daß in
rDNA-NPM=
Bereichen während der S-Phase Holliday junctions gebildet werden und daß die Bildung abhängig von Rad52 ist, nicht aber von Rad51, Rad55 und Rad57 (wçì C oçíÜëíÉáå, NVVT).
Als eine weitere Möglichkeit können mit Hilfe von Dichtegradientenzentrifugation nach Dichtemarkierung der DNA Replikationsintermediate isoliert werden. Mittels diese Methode konnte durch eáÖÖáåë et al. die Bildung von Holliday junctions in humanen Zellen gezeigt werden (eáÖÖáåë et al., NVTS). Zu diesem Zweck wurden humane Zellen in normalem Medium angezogen. Anschließend wurden die Zellen 2 h mit Bromdeoxy-uridin (BrdU) inkubiert. Dem Medium wurde für 1 h MMS zugesetzt und anschließend die Zellen für 1 h in Medium mit BrdU aber ohne MMS postinkubiert. Die DNA wurde geschert und auf einem neutralen Cäsiumchlorid-Gradienten aufgetrennt. Man sollte erwarten, daß die Replikationsintermediate eine intermediäre Dichte besitzen. Aus den entsprechenden Fraktionen wurde DNA präpariert. Mit Hilfe von Elektronenmikroskopie konnten Holliday junctions in der derart präparierten DNA nachgewiesen werden (eáÖÖÉåë et al., NVTS).
Durch eine ähnliche experimentelle Prozedur konnten auch in befruchteten Eizellen von Drosophila melanogaster Holliday junctions nach Behandlung mit Mutagenen nach-gewiesen werden (fåã~å, NVUQ).
Derartige Strukturen konnten bisher in Wildtypzellen von Saccharomyces cerevisiae nach Behandlung mit Hydroxyharnstoff nicht direkt nachgewiesen werden. In ebenso behandelten rad53-Deletionsmutanten wurden hingegen eine Reihe ungewöhnlicher Strukturen elektronenmikroskopisch detektiert, unter denen sich auch Holliday junctions befanden. Offenbar sorgt also die Auslösung des checkpoints durch Rad53 in Wildtyp-zellen dafür, daß die Entstehung von ungewöhnlichen Replikationsintermediaten ver-mieden wird (pçÖç et al., OMMO).
Die Problematik sowohl bei dem Nachweis von Doppelstrangbrüchen als auch bei dem direkten Nachweis von Replikationsintermediaten, welche an Arresten der Replika-tion entstehen, besteht darin, daß artifizielle Bedingungen gewählt werden müssen, um derartige Strukturen überhaupt zu finden. Es wäre ein Vorteil, wenn ein experimentelles System auch unter normalen Wachstumsbedingungen einen Einblick in die Mechanismen zur Umgehung von DNA-Läsionen leisten könnte.
Indirekte Systeme zum Nachweis von Reinitiationsintermediaten
In E. coli führen Mutationen von Genen, welche eine Instabilität
der Replikationsgabeln bewirken, vermehrt zur Deletion von Sequenzduplikationen
Es sprechen viele Befunde dafür, daß der Nachweis von Replikationsarresten auch indirekt auf genetischem Wege erfolgen kann. So konnte durch içîÉíí et al. gezeigt werden, daß die Deletion bestimmter Gene einen Einfluß auf die Stabilität direkter Sequenzwiederholungen hat. Dies gilt sowohl für plasmidlokalisierte als auch für
NPN
chromosomal lokalisierte Sequenzwiederholungen. Diese Ereignisse sind nur partiell vom Vorhandensein von RecA abhängig (içîÉíí et al., NVVP).
Durch p~îÉëçåCiçîÉíí wurde anhand dieses Systems gezeigt, daß die Inaktivierung der replikativen Helikase DnaB in E. coli zu einer deutlich erhöhten Rate von Deletions-ereignissen führt. Es wurde spekuliert, daß in diesen Mutanten häufiger Replikations-gabeln arretieren. Die hierbei vermehrt entstehenden Doppelstrangbrüche wären dann für die verstärkt auftretenden Deletionen verantwortlich (p~îÉëçå C içîÉíí, NVVV). Ein ähnlicher Effekt ließ sich bei der Deletion von holD beobachten, welches eine Kompo-nente des clamp loaders ist. Auch hier wurde die Hypothese aufgestellt, daß es durch das Fehlen von HolD zu einer Destabilisierung des Replisoms und damit häufiger zu Arresten der Replikation kommt. Diese würden dann vermehrt zu doppelsträngigen DNA-Enden und somit vermehrt zu Deletionen der Sequenzwiederholungen führen (cäçêÉë et al., OMMN)
Durch _áÉêåÉ et al. wurde die Hypothese aufgestellt, daß, sofern doppelsträngige DNA-Enden für die Instabilität von Sequenzwiederholungen zuständig sind, die Deletion von recD eine massive Erhöhung der Deletionsfrequenz von Duplikation zur Folge haben sollte, da hier die Halbwertzeit auftretender linearer DNA durch die fehlende Exonukleaseaktivität des RecBCD-Komplexes deutlich erhöht sein sollte. Genau dieser Effekt konnte in recD-Deletionsmutanten nachgewiesen werden (_áÉêåÉ et al., NVVTb).
Geht man davon aus, daß die Deletionsereignisse auf einer Stranginvasion des durch den RecBCD-Komplex hervorgerufenen einzelsträngigen 3’-Endes beruhen, dann sollte die Deletion von recA zu einer massiven Erniedrigung der Deletionsereignisse führen, da das RecA-Protein für die homologiebasierte Invasion des einzelsträngigen 3’-Endes sorgt (`çñ et al., OMMM; jáÅÜÉä et al., OMMN). Interessant ist, daß sowohl von içîÉíí et al. als auch von _áÉêåÉ et al. gezeigt wurde, daß die Deletion von recA sowohl im Falle von plasmidbasierten Systemen als auch bei chromosomal lokalisierten Sequenzwieder-holungen nur zu einer moderaten Erniedrigung der Deletionsraten führt. Aus diesen Daten wurde gefolgert, daß es offenbar neben der recA-abhängigen Rekombination weitere Prozesse gibt, welche für die Deletionsereignisse eine wichtige Rolle spielen (içîÉíí et al., NVVP; _áÉêåÉ et al., NVVTÄ).
Eine vorgeschlagene Möglichkeit ist hierbei das sogenannte primer template slippage, bei welchem ein Primer kurzzeitig vom template gelöst wird und an der falschen Position wieder mit diesem hybridisiert, wobei eine Schleife ausbildet wird, welche aus den über-sprungenen Basen besteht (içîÉíí et al., NVVP; _áÉêåÉ et al., NVVTÄX=jáÅÜÉäI=OMMM).
In Eukaryonten führt die Behandlung mit Mutagenen zu einer Erhöhung der Frequenzen von Deletionsereignissen
Wenn der Arrest der Replikationsgabel zur Bildung doppelsträngiger DNA-Enden und damit zur Deletion von Sequenzwiederholungen führt, dann sollte die Behandlung mit Chemikalien, welche replikationsarretierende Läsionen zur Folge haben, zu einer erhöhten Frequenz von Deletionsereignissen führen.
NPO=
Diese Hypothese konnte durch Experimente in Hamsterzellen gestützt werden. Für die Messungen wurde eine hprt–-Mutante gewählt, bei welcher im hprt-Gen Exon 7 sowie ein Teil von Exon 6 spontan dupliziert war. Hier konnten Deletionen der Duplikation durch Selektion auf den HPRT+-Phänotyp identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, daß sich die Frequenz von Deletionsereignissen durch die Behandlung mit Camptothecin steigern läßt (^êå~ìÇÉ~ì et al., OMMN).
Dieser Effekt wurde auch bei dem in dieser Arbeit verwendeten experimentellen System in Saccharomyces cerevisiae nachgewiesen. Sowohl die Behandlung der Zellen mit Camptothecin als auch mit 4-NQO führte zu einer Erhöhung der Deletion von Sequenz-wiederholungen. Dies galt sowohl für Duplikationen, welche sich auf einem Plasmid befanden, wie auch für chromosomal lokalisierte Duplikationen.
Eignet sich die Messung der Deletionen von Sequenzduplikationen für die Bestimmung von Replikationsarresten?
Prinzipiell lassen sich die in Sequenzduplikationen auftretenden Deletionsereignisse auf drei unterschiedliche Mechanismen zurückführen.
1) Deletionen können durch sogenanntes primer template slippage entstehen. Diese Hypothese wird durch die Befunde unterstützt, daß nur ein Teil der Deletions-ereignisse in E. coli auf die Anwesenheit von RecA zurückgeht.
2) Deletionen können durch die Reparatur von nicht replikationsinduzierten Doppel-strangbrüchen entstehen. Entsteht in der Nähe einer Sequenzwiederholung ein Doppelstrangbruch, so wird das Ende durch die Enzyme der Doppelstrangbruch-reparatur prozessiert. Hierdurch entsteht ein einzelsträngiges 3’-Ende, das in das intakte Chromosom eingeführt werden kann. In E. coli ist die Reparatur von Doppel-strangbrüchen auf diesem Weg nur möglich, wenn nach der Replikation ein zweites Chromosom in der Zelle vorliegt (hìòãáåçî, NVVR).
3) Deletionsereignisse können durch arretierte Replikationsgabeln ausgelöst werden, wobei hier zwei Mechanismen denkbar sind:
a) Es wurde bereits darauf hingewiesen, daß eine Läsion auf dem lagging strand template nicht zu einem Arrest der Replikationsgabel führt, sondern daß lediglich ein Okazaki-Fragment nicht geschlossen werden kann (siehe Seite NT). Die ent-stehende Lücke kann entweder mittels Transläsionssynthese oder über rekombinative Prozesse geschlossen werden. Es ist also denkbar, daß es im Zuge der rekombinativen Prozesse ebenfalls zu Deletionen kommt.
b) Es kann zu einem Arrest der leading strand Polymerase kommen, welcher in der Bildung einer Holliday junction resultieren kann. Wird diese geschnitten, entsteht ein doppelsträngiges DNA-Ende, welches wie beschrieben durch die Enzyme der Doppelstrangbruchreparatur prozessiert werden kann, um eine Reinitiation zu ermöglichen.
Um zu untersuchen, welcher Anteil an Deletionsereignissen in Saccharomyces cerevisiae auf homologe Rekombination zurückzuführen ist, wurde die spontane Reversionsrate des
NPP
verwendeten KanKanMX4-Moduls in rad52-Deletionsmutanten untersucht. Da das Rad52-Protein eines der Schlüsselenzyme der Rekombination ist (^ÖìáäÉê~, OMMN), sollte man erwarten, daß sich aus der Rate der Reversionsereignisse in rad52-Mutanten ableiten läßt, welchen Einfluß rekombinative Prozesse auf die spontane Reversionsrate haben.
In einer rad52-Deletionsmutante wurde eine 40fache Erniedrigung der spontanen Reversionsrate gemessen. Dies ist ein guter Hinweis dafür, daß die Rad52-abhängige Rekombination eine prominente Rolle bei der Entstehung von Reversionsereignissen in Saccharomyces cerevisiae spielt. Allerdings ist die spontane Reversionsrate einer rad52 mph1-Doppelmutante noch stärker erniedrigt; diese genetische Interaktion ist formal synergistisch. Dieser Befund könnte dergestalt erklärt werden, daß Mph1 an einem alternativen Prozeß beteiligt ist, wobei beide Prozesse partiell überlappende Substrat-spektren besitzen. Es könnte sich also um den in E. coli unabhängig von RecA ablaufenden Prozeß handeln, für welchen postuliert wurde, daß es sich um primer template slippage handelt (içîÉíí et al., NVVP; _áÉêåÉ et al., NVVTb).
Natürlich kann eine Beteiligung von Mph1 an einem Prozeß, welcher vermehrt zu primer template slippage Ereignissen führt, nicht ausgeschlossen werden. Gegen diese Hypothese sprechen allerdings mehrere Befunde.
So konnte in Saccharomyces cerevisiae gezeigt wurde, daß die mitotische Rekombina-tionsrate in sgs1-Deletionsmutanten sowohl bei homeologen (jóìåÖ=et al., OMMN) als auch bei homologen Substraten erhöht ist (t~íí=et al., NVVS; jóìåÖ=et al., OMMN). Diese erhöhte Rate mitotischer Rekombination ist dabei jedoch nur teilweise von Rad52 ab-hängig (t~íí=et al., NVVS). Offenbar gibt es also in Hefe zu Rad52 alternative Wege, welche ebenfalls rekombinativ sind.
Weiterhin konnten sowohl für die spontanen Mutationsraten als auch für die Sensitivi-täten gegenüber Mutagenen epistatische Interaktionen von rad51 und rad55 mit mph1 gezeigt werden (pÅÜΩêÉê et al., in Vorbereitung). Diese Befunde deuten eher auf eine Beteiligung von Mph1 an einem rekombinativen Prozeß hin.
Neben diesen Befunden deuten die Daten der Mutationsraten sowie der induzierten Mutagenese darauf hin, daß Mph1 vornehmlich an der fehlerfreien Umgehung kleiner DNA-Läsionen beteiligt ist und daß diese in Abwesenheit von Mph1 gezielt durch die Transläsionssynthese überlesen werden. Es ist also vergleichsweise schwer vorstellbar, warum es bei einem Arrest der Polymerasen an kleinen DNA-Läsionen im Wildtyp durch die Aktivität von Mph1 zur fehlerfreien Umgehung der Läsionen vermehrt zu primer template slippages kommen sollte, während in mph1-Mutanten die letztgenannten durch den Einsatz der Transläsionssynthese vermieden werden. Vielmehr erscheint es u. a. auf-grund der Epistasis von mph1 zu rad51 und rad55 plausibel, daß Mph1 an einem weiteren rekombinativen Wegen zur Umgehung von DNA-Läsionen beteiligt ist. Aufgrund der synergistischen Interaktion von mph1 mit rad52 bezüglich der spontanen Reversionsraten könnte man postulieren, daß diese rekombinativen Wege unabhängig von Rad52 sind.
Eine Beteiligung von Mph1 an der rekombinativen Reparatur von Doppelstrang-brüchen erscheint hingegen unwahrscheinlich, da mph1-Mutanten keine ausgeprägte
NPQ=
Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung besitzen (pÅÜÉääÉê et al., OMMM). Hinzu kommen experimentelle Daten, nach denen mph1-Mutanten einen Hyperrekombina-tionsphänotyp besitzen (A. pÅÜΩêÉê, unveröffentlicht). Auch dies spricht gegen eine Beteiligung von Mph1 an der rekombinativen Reparatur von Doppelstrangbrüchen.
Die vorhandenen Daten deuten also darauf hin, daß in Saccharomyces cerevisiae die beobachteten Deletionsereignisse hauptsächlich auf rekombinative Mechanismen zurück-zuführen sind, während dem primer template slippage nur eine untergeordnete Bedeutung zukommt. Eine Beteiligung von Mph1 am letztgenannten Mechanismus kann zwar nicht ausgeschlossen werden, erscheint aber aufgrund der genetischen Befunde eher unwahr-scheinlich. Offensichtlich lassen sich also anhand des KanKanMX4-Moduls Rekombina-tionsereignisse nachweisen, welche in Zusammenhang mit Replikationsprozessen stehen.
Das System unterscheidet allerdings nicht zwischen Rekombinationsprozessen zur Reini-tiation der leading strand Polymerase und dem Auffüllen einzelsträngiger DNA-Bereiche des lagging strand.
Ein großer Vorteil dieses genetischen Systems besteht im Vergleich zu den bio-chemischen Methoden allerdings darin, daß sich die Deletionereignisse sowohl unter
»natürlichen« Bedingungen als auch nach Behandlung mit Mutagenen problemlos bestimmen lassen.