Das MPH1-Gen (für mutator phenotype) aus Saccharomyces cerevisiae befindet sich auf dem rechten Arm von Chromosom IX und kann für ein Protein von 993 Aminosäuren codieren. Die Aminosäuresequenz weist die sieben konservierten Motive auf, die für die Proteine der DEAD/DExH-Box-Helikasenfamilie charakteristisch sind (pÅÜÉääÉêet al., OMMM). Eine mph1-Deletionsmutante zeigt neben einer marginalen Sensitivität gegenüber UV eine deutlich erhöhte CAN1-Vorwärtsmutations- sowie trp1-289-Reversionsrate. Die Sensitivität gegenüber DNA-schädigenden Agenzien wie MMS, EMS, 4-NQO und Camptothecin ist erhöht. Neben diesen Sensitivitäten sowie dem beobachteten Mutator-phänotyp wurden bei einer Vielzahl weiterer Untersuchungen zu Störungen im Zell-zyklus, des Wachstums auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen, der Zellmorphologie und des Cytoskeletts, der Mitochondrienfunktion, der Paarung und der Streßantwort keine auffälligen Phänotypen gefunden (båíá~å et al., NVVV).
Weitere Untersuchungen erlaubten eine Eingrenzung des Wirkortes des Pro-teins. Durch eine große Zahl von Epistasisanalysen konnte eine Beteiligung des Mph1-Proteins an einem der bekannten Reparaturwege wie Nukleotidexcisionsreparatur, Basen-excisionsreparatur und mismatch-Reparatur mit hoher Wahrscheinlichkeit ausge-schlossen werden (pÅÜÉääÉê et al., OMMM; pÅÜΩêÉê et al., in Vorbereitung). Durch ein PCR-basiertes experimentelles System zur quantitativen Messung von DNA-Schäden konnte gezeigt werden, daß die Zugänglichkeit der DNA für Mutagene in mph1-Mutanten nicht deutlich erhöht ist, so daß vermutlich auch Strukturveränderungen z. B. des Chromatins und eine daraus resultierende verbesserte Zugänglichkeit der DNA für Muta-gene nicht für die Erhöhung der Mutationsrate verantwortlich sind (pÅÜΩêÉê et al., in Vorbereitung). Auch für eine Beteiligung des Mph1-Proteins an Prozessen wie dem RNA-splicing, der Translation oder dem nukleären Transport konnten keine Hinweise gewonnen werden (pÅÜÉääÉê et al., OMMM).
Bei weiteren Untersuchungen zur näheren Eingrenzung der möglichen Funktion des Mph1-Proteins wurden genetische Interaktionen des MPH1-Gens u. a. mit SGS1, MMS4 (pÅÜΩêÉê et al., in Vorbereitung) und SRS2 (E. m~åáÅçI unveröffentlicht) gezeigt. Von allen Genen wird angenommen, daß sie u. a. an der Reinitiation arretierter Replikations-gabeln beteiligt sind. Diese Befunde haben zusammen mit weiteren Ergebnissen zu der Hypothese geführt, daß das Mph1-Protein ebenfalls an der Reinitiation arretierter Replikationsgabeln beteiligt ist. Anhand dieser Hypothese ließe sich der Mutator-phänotyp dadurch erklären, daß die Reinitiation von an Läsionen arretierten Replikationsgabeln in Abwesenheit von Mph1 vermehrt mittels der Transläsionssynthese erfolgt.
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich die Hypothese einer Beteiligung von Mph1 an einem Prozeß zur Reinitiation arretierter Replikationsgabeln bestätigen läßt und ob sich die Funktion des Proteins weiter eingrenzen läßt. Durch die zusätzliche
OT
Untersuchung der Rolle von Proteinen, für welche genetische Interaktionen mit MPH1 gezeigt wurden und welche vermutlich ebenfalls an Reinitiationsprozessen beteiligt sind, sollte versucht werden, zur Klärung der in Eukaryonten im Vergleich zu E. coli weniger gut verstanden Prozesse beizutragen.
OU
MATERIAL
Chemikalien
α mating factor Hergestellt im Institut
Adenin Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Agar bacteriological (Agar No. 1) Oxoid, Wesel
Agarose Biozym, Hess. Oldendorf
Ammoniumsulfat Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Ampicillin-Natriumsalz AppliChem, Darmstadt
BactoPepton Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Spanien
Blei(II)citrat Fluka Chemie AG, Neu-Ulm
Borsäure Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Spanien
Bromphenolblau Fluka Chemie AG, Neu-Ulm
BSA USB, Cleveland Ohio, USA
Camptothecin Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen
ä-Canavanin Calbiochem, Schwalbach
Chloroform Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Spanien DAPI (2,4-Diamidino-2-Penylindol) AppliChem, Darmstadt
Dimethylsulfoxid (DMSO) Fluka Chemie AG, Neu-Ulm
dNTPs Invitek, Berlin
1,4-Dithio-Çä-threit(ol) (DTT) AppliChem, Darmstadt
EDTA Dinatriumsalz Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Essigsäure Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Ethanol Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
G418 Calbiochem, Schwalbach
Glucose Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Glycerin Serva, Heidelberg
Hefeextrakt Oxoid, Wesel
Hydroxy 8-Hydroxychinolin Fluka Chemie AG, Neu-Ulm
IPTG AppliChem, Darmstadt
Kaliumchlorid Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Kaliumdihydrogenphosphat Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Spanien
Kanamycin Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Lachsspermien-DNA Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen
Leucin Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen
Lithiumacetat Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen Lowicryl-K4M-Harz Chemische Werke Lowi, Waldkraiburg
OV
Methylmethansulfonat (MMS) Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen
MOPS AppliChem, Darmstadt
Natriumazid Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Natriumchlorid Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Di-Natriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Natriumhydroxid Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Natriumlaurylsulfat Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe 4-Nitrochinolin-1-oxid Fluka Chemie AG, Neu-Ulm
Phenylalanin Fluka Chemie AG, Neu-Ulm
Polivinylformaldehyd Serva (Heidelberg)
Polyethylenglycol 4000 Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen Polylysin-Lösung Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen 2-Propanol (Isopropanol) Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
RNAse Roche Diganostics GmbH, Mannheim
Saccharose Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Salzsäure Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Sorbitol Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen
SYBR™Green I Fluka Chemie AG, Neu-Ulm
Tris-Base AppliChem, Darmstadt
Triton X-100 Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen
Trypton Oxoid, Wesel
Tween 20 Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen
Uracil Fluka Chemie AG, Neu-Ulm
Uranylacetat Fluka Chemie AG, Neu-Ulm
X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl- β-Ç-galactopyranosid)
AppliChem, Darmstadt
Yeast Lytic Enzyme ICN Biomedicals, Costa Mesa, USA
Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and ammonium sulfate
DIFCO, Dreieich
Alle nicht explizit aufgeführten Chemikalien wurden von der Firma Merck KGaA, Darm-stadt, bezogen.
Enzyme
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP) MBI Fermentas, Vilnius, Litauen
NEE-154 Glusulase NEN™, Boston, USA
Restriktionsendonukleasen MBI Fermentas, Vilnius, Litauen; New England Biolabs, Bad Schwalbach
T4-DNA-Ligase MBI Fermentas, Vilnius, Litauen T4-DNA-Polymerase MBI Fermentas, Vilnius, Litauen Taq-DNA-Polymerase Hergestellt im Institut
PM=
Vent-DNA-Polymerase New England Biolabs, Bad Schwalbach Yeast Lytic Enzyme aus Arthrobacter luteus
(8000 u · mg–1)
ICN Biomedicals