LC-MS/MS-Methode

Für die eigenen Untersuchungen stand eine LC-MS/MS-Anlage zur Verfügung (s. Kap. 3.3.6). Wurden früher die Analysen mit Dünnschicht-, Gas- oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie durchgeführt, wird heute meist die HPLC-MS/MS-Technik eingesetzt (s. Tab. 3. 1), da zusätzlich zur Retentionszeit auch die Angaben über das Masse-Ladung-Verhältnis der Moleküle ermittelt wird.

Die Konditionen der LC-MS/MS-Anlage (Säule, Eluenten, Gradientenverlauf) orientierten sich an den Bedingungen der Arbeit von ÖZMEN (2014). Dort wurden mit dem gleichen Gerät mit den in Tab. 3. 10 beschriebenen Komponenten und Laufbedingungen Flavonoide in Grassilagen nachgewiesen.

Mit den in Kap. 3.3.6 beschriebenen Arbeitsbedingungen der LC-MS/MS-Anlage konnten alle verwendeten Flavonoid-Standards sehr gut getrennt und detektiert werden.

Eine Ausnahme bildeten Apigenin und Genistein. Beide Stoffe haben das gleiche Masse-Ladung-Verhältnis (271 m/z) und eluieren zur gleichen Retentionszeit, so dass sie einen Peak bildeten. Versuche, mit einem anderen Eluenten (Methanol statt Acetonitril + 0,1 % Ameisensäure) eine bessere Trennung zu erzielen, blieben

116

erfolglos, so dass für diese beiden Stoffe eine gemeinsame Auswertung vorgenommen wurde.

Für den Ionisierungsvorgang kam die Elektrospray-Ionisation (ESI) zum Einsatz und die Detektion der Molukül-Ionen erfolgte bei positiver Spannung. Die Ergebnisse aus den Arbeiten von KRAJČOVÁ et al. (2010), TŘINÁCTÝ et al. (2009) und WATZKOVÁ et al. (2010) wurden hingegen alle mit dem Verfahren der chemischen Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI) erzielt. ÖZMEN (2014) nutzte zur Analyse von Flavonoiden die Elektrospray-Ionisation mit einem positiven Modus und hat damit die besten Ergebnisse bei der Flavonoidanalytik erzielt. Aus diesem Grund wurden dieselben Einstellungen für die eigenen Untersuchungen genutzt.

Als Eluenten nutzten KRAJČOVÁ et al. (2010), TŘINÁCTÝ et al. (2009) und WATZKOVÁ et al. (2010) Wasser mit 1 % Ameisensäure (Eluent A) und Methanol (Eluent B).

Für die eigenen Untersuchungen wurde als Eluent A Wasser mit 0,1 % Ameisensäure und als Eluent B Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure verwendet.

Versuche, Methanol als Eluent B zu verwenden, brachten keine Verbesserung der Trennleistung und der Signalstärke am Detektor, so dass weiterhin wie bei ÖZMEN (2014) Acetonitril eingesetzt wurde.

Zur Quantifizierung der Flavonoide wurde für alle Zielanalyten mit Hilfe eines Mischstandards eine 10-Punkt-Kalibrierung im Bereich von 20 - 2400 ng/ml durchgeführt. KRAJČOVÁ et al. (2010) konnten bei der Kalibrierung bis 2,5 ng/ml heruntergehen, allerdings war es mit der eigenen LC-MS/MS-Anlage nicht möglich, in so niedrigen Konzentrationsbereichen noch auswertbare Signale zu produzieren.

Für alle Kalibriergeraden konnte das lineare Regressionsmodell genutzt werden. Das Bestimmtheitsmaß R² der Kalibrierfunktionen lag für die verschiedenen Flavonoide zwischen 0,9997 und 0,9960 und damit sehr nahe an dem optimalen Wert von 1.

BERGER (2012) gab in ihrer Arbeit einen vergleichbaren R² von 0,9966 für die Kalibriergerade von Quercetin an sowie weitere R² von 0,9794, 0,9860 und 0,9948 für drei aus Quercetin entstehende Metaboliten an. KRAJČOVÁ et al. (2010), TŘINÁCTÝ et al. (2009) und WATZKOVÁ et al. (2010) machten keine näheren Aussagen über die Qualität ihrer Kalibration.

Die Nachweisgrenzen (LOD) lagen in den eigenen Untersuchungen für die Analyten zwischen 10 - 20 ng/ml (Tab. 3. 4).

In der Literatur sind für die Flavonoidanalyse im Rinderblut mit Hilfe der LC-MS/MS folgende Nachweis- und Bestimmungsgrenzen beschrieben (Tab. 5. 4):

117

Tab. 5. 4: In der Literatur beschriebene Nachweisgrenzen (LOD) bei der Messung von ausgewählten Flavonoiden mit der LC-MS/MS

Stoff LOD (ng/ml) Autor / Jahr

Daidzein 2,5 KRAJČOVÁ et al. 2010 Genistein 5,0

Equol 0,5

Daidzein 2,5 TŘINÁCTÝ et al. 2009 WATZKOVÁ et al. 2010 Genistein 5,0

Equol 2,5

Quercetin 3,0 BERGER 2012

Die Nachweisgrenzen der eigenen Methode liegen in höheren Bereichen als bei den anderen Studien. Mögliche Gründe hierfür liegen vor allem in der Leistungsfähigkeit der verwendeten LC-MS/MS-Anlage sowie deren Komponenten.

Aufgrund der Verunreinigung der Enzymlösung mit Acacetin, Apigenin + Genistein, Diosmetin und Luteolin stellt sich die Verwendung der Enzymlösung bei der Analyse von Blutproben wie die Anwendung eines Additionsverfahrens dar. Da der Flavonoidgehalt in der Enzymlösung bekannt war, wurde die zugesetzte Menge nach der Analyse und Auswertung der Blutproben herausgerechnet. Auf Grund dieses Vorgehens wurde für die Stoffe Acacetin, Apigenin + Genistein, Diosmetin und Luteolin grundsätzlich oberhalb der Nachweisgrenzen gearbeitet, so dass diese dort keine Bedeutung hatten.

Mit den oben beschriebenen Bedingungen konnten folgende Validierungsparameter erzielt werden:

Die Wiederfindungsrate der Standards lag bei 73,0 % – 99,4 % (s. Tab. 3. 8).

KRAJČOVÁ et al. (2010) geben Wiederfindungsraten im Plasma zwischen 81 % - 112 % an. Bei TŘINÁCTÝ et al. (2009) und WATZKOVÁ et al. (2010) wurden keine Daten zur Wiederfindung genannt. Da bei den eigenen Ergebnissen alle Standards außer Quercetin (73 %) eine Wiederfindungsrate von über 85 % aufwiesen, waren die Werte vergleichbar mit denen von KRAJČOVÁ et al. (2010).

Die durchschnittlichen Variationskoeffizienten in Serie (n = 4) für die Messung mit der LC-MS/MS lagen für die Standards ohne Aufarbeitung zwischen 5,16 % und 7,47 %.

Mit vorheriger Aufarbeitung nach Abb. 3. 7 lagen die VKs zwischen 5,79 % und 8,16 %.

118

Tab. 5. 5: Variationskoeffizienten in Serie (n = 4) der Standards ohne und mit Aufarbeitung

Standard VK (%) ohne Aufarbeitung VK (%) mit Aufarbeitung

Acacetin 6,04 6,78

Api+Geni 6,79 7,23

Biochanin A 7,46 7,88

Diosmetin 5,60 6,02

Formononetin 5,16 5,79

Kaempferol 6,81 7,45

Luteolin 7,47 8,16

Quercetin 7,26 7,86

4-HBP 5,31 6,08

DMCA 6,57 6,94

Alle Variationskoeffizienten lagen unter 8,2 % und somit wiesen die Aufarbeitung und die Messung keine großen Schwankungen auf. Die Messung mit der LC-MS/MS schien einen größeren Einfluss auf die Streuung zu haben als die Aufarbeitung, da diese nur zu einer geringen Erhöhung der Gesamt-VKs führt (s. Tab. 5. 5).

In der Literatur sind für die Flavonoidmessung im Rinderblut mittels LC-MS/MS keine Variationskoeffizienten beschrieben, so dass keine Vergleichsmöglichkeit bestand.

Die Methode für die Quantifizierung bestimmter Flavonoide im Serum von Rindern mittels LC-MS/MS wurde in Anlehnung an die Methode von KRAJČOVÁ et al. (2010) und ÖZMEN (2014) entwickelt. Im Vergleich mit anderen Methoden aus der Literatur wurde deutlich, dass das Vorgehen und die Kalibrierungs- und Validierungsparameter mit denen der eigenen Methode vergleichbar waren und die Methode somit geeignet war, für die Analyse der Blutproben der eigenen Untersuchungen eingesetzt zu werden.