3. Material, Puffer und Antikörper
4.4 Kultivieren von Pankreastumorzelllinien
4.4.1 Arbeiten mit Zellkulturen
Jeglicher Umgang mit Zellen, das Auftauen, Verdünnen, Splitten (Teilen) und Einfrieren fand unter keimreduzierten Bedingungen in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank statt.
Vor jedem Verbringen der Zellkulturschalen und Arbeitsgegenstände in die Sicherheitswerkbank wurden alle Gegenstände mit 70%igem Ethanol desinfiziert. Bei Gegenständen mit direktem Kontakt zu den Zellen handelte es sich um autoklavierte Einwegartikel. Mehrweggegenstände wurden vor Gebrauch autoklaviert. Medien, Waschlösungen und Chemikalien wurden, soweit erforderlich, vor Gebrauch autoklaviert.
Zell- und Waschlösungen sowie Gegenstände, die in Kontakt mit Zellen oder Zellsuspensionen gekommen sein könnten, wurden in speziellen Behältnissen gesammelt und vor Entsorgung autoklaviert. Die Oberflächen der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank
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wurden vor und nach Benutzung mit UV-Licht desinfiziert. In regelmäßigen Abständen wurden von jeder kultivierten Zelllinie Proben entnommen und mittels PCR-Verfahren auf Kontamination durch Mykoplama untersucht.
4.4.2 Auftauen und kultivieren von Zelllinien
Die den Zelllinien entsprechenden Nährmedien und Zusätze sowie das Wachstumsverhalten und das Teilungsverhältnis der Zellen sind im Kapitel Material, Zelllinien für jede Zelllinie aufgeführt. Zellmedien und andere Lösungen und Chemikalien wurden vor Zugabe zu den Zellen auf 37 °C erwärmt. Die bei -80°C tiefgefrorenen Zelllinien wurden für 30 Sekunden bei 37°C im Wasserbad angetaut und anschließend in 10 ml des entsprechenden Mediums überführt. Die jetzt im Medium vollkommen aufgetauten Zellen wurden bei 300 x g für 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Pellet in 6 ml Medium durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Die Zellsuspension wurde auf 2 60 mm Ø Zellkulturschalen verteilt, eine mit 5,5 ml, die zweite mit 0,5 ml + 5 ml Medium. Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlenstoffdioxid inkubiert.
4.4.3 Mediumwechsel und Teilen (Splitten) der Zellen
Waren die Zellen in den Zellkulturschalen zu einem dichten Zellrasen gewachsen, mussten sie auf mehrere neue Schalen auf geteilt werden (Splitten). Im Zuge dessen erhielten die Zellen neues Medium. War das Medium schon vor Erreichen des dichten Zellrasens verbraucht, wurde es gewechselt ohne die Zellen in neue Schalen umzusiedeln. In jedem Fall wurde 2-mal wöchentlich das Medium ausgewechselt. Das Wachstumsverhalten der Zellen wurde täglich mikroskopisch begutachtet. Dabei wurde auf ein homogenes Erscheinungsbild der Zellen, Zellkerngröße, Kern-Zytoplasmarelation, auf den Kontakt der Zellen zum Untergrund, sowie auf Zell-Zell-Verbindungen, auf das Auftreten von Vakuolen als Zeichen von Degeneration und Apoptose, sowie auf apoptotische, frei schwimmende Zellen geachtet.
Abweichend von den im Materialkapitel angegeben Teilintervallen wurden die Zellen individuell gesplittet, falls das Zellwachstum dies erforderte. Beim Splitten wurde so vorgegangen:
Das Medium wurde abgesaugt und der Zellrasen 1-mal mit PBS gewaschen. Auf eine 60 mm Ø Zellkulturschale wurden 500µl Trypsin-EDTA gegeben, der Zellrasen damit bedeckt und die Schale für 5 Minuten in den Brutschrank gegeben. Fall noch erforderlich wurden die Zellen durch behutsames Klopfen der Schale gelöst. Die Zellsuspension wurde zu 10 ml Medium gegeben um das restliche, aktive Trypsin zu inhibieren. Die Suspension wurde bei 300 x g für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 10 ml Medium aufgenommen und den angegebenen Splitt-Verhältnissen entsprechend auf neue Platten mit frischem Medium aufgeteilt.
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Die Zellen wurden für weitere Versuche erst verwendet, wenn sie gleichmäßig gewachsen waren und mindestens 5 Kulturpassagen durchlaufen haben.
4.4.4 Herstellen von Zelllysaten
Das Medium der zu einem möglichst dichten Zellrasen gewachsenen Zelllinien wurde abgesaugt, die Zellen 3-mal mit eiskaltem PBS gewaschen und anschließend mit Lysepuffer bedeckt und 10 Minuten auf Eis inkubiert.
Zur Zelllyse wurde in Anlehnung an einen RIPA-Puffer folgender Lysepuffer verwendet:
145 mM NaCl 5 mM KCl
50 mM Tris HCl pH 7,5 1% Triton X 100
50 mM EDTA 100 mM NaF 1mM Pefablock
2 x Complete Proteasehemmer 0,02% Trypsininhibitor
RIPA Puffer wurden ursprünglich zur schonenden Zelllyse für Radio-Immuno-Präzipitations-Assays verwendet. Die Proteasehemmer, Pefablock, Complete-Proteasehemmer und Trypsin-Inhibitor wurden stets zum fertigen Puffer frisch zugegeben. Sie wurden durchgehend eisgekühlt. Nach 10-minütiger Inkubation des Lysepuffers auf Eis wurden die Zellen mit einem sterilen Gummischaber von der Petrischale gestrichen, in ein Kryogefäß überführt, bei -80°C schockgefroren und anschließend auf Eis langsam wieder aufgetaut. Das Schockgefrieren sollte den Lyseprozess unterstützen.
Die aufgetauten Proben wurden dann für weitere Versuche in kleinen Aliquotes bei -40°C im Lysepuffer eingefroren oder für den Western-Blot im Verhältnis 1:4 mit 4-fach Laemmlipuffer mit ß-Mercaptoethanol für 3 Minuten gekocht und dann bei -20°C eingefroren.
39 4.4.5 Qualitative Proteinanalyse von Zelllysaten
Vor Auftrag der Zelllysate auf Gele wurde die Proteinkonzentration der Proben mittels Bradford-Test bestimmt und die aufgetragene Proteinmenge durch Probenverdünnung in etwa angeglichen. Bei einigen Lysaten mit sehr geringen Proteinkonzentrationen wurde die maximale Proteinmenge aufgetragen. Ein quantitativer Vergleich ist daher nicht in jedem Fall möglich gewesen. 10µl Zelllysat wurden mit 5µl Lysepuffer und 5µl 4-fach Probenauftragspuffer vermischt, kurz aufgekocht und dann auf die Gele aufgetragen. Bei proteinarmen Zelllysaten wurden 15µl Lysat mit 5µl 4-fach Probeauftragspuffer auf das Gel gegeben, hoch konzentrierte Lysate wurden 1:2 mit Lysepuffer verdünnt (CAPAN1 und PaTu-8988 S). Für die Detektion von S100A8/A9 Protein wurden 16% Schägger-Gele verwendet, für Reg3A sowie die GAPDH-Kontrollen kamen 14% Laemmli-Gele zum Einsatz. Die detaillierte Zusammensetzung der Gele und Puffer ist im Kapitel Material, Puffer und SDS-Gele aufgeführt. Der Ablauf von Elektrophorese und Western-Blot ist im Kapitel Methoden genau beschrieben. Nach der Elektrophorese wurde ein Gel jedes Versuchs nach Coomassie gefärbt, um den Proteinauftrag und die Proteinauftrennung zu kontrollieren. Als Kontrollenzym für die Herstellung der Zelllysate und für eine gleichmäßige Übertragung der Proteine auf die Nitrozellulose-Membran wurde das GAPDH-Enzym im Immunoblot detektiert. Die Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase ist ein Enzym, das bei der Glykolyse die Umwandlung von Glycerinaldehyd-3-Phophat zu 1,3-Bisphosphoglycerat (Oxidation des Aldehyds ohne Energieverlust) katalysiert und daher in Säugerzellen unentbehrlich ist. Eine Nitrozellulosemembran jedes Versuchs wurde ohne Primärantikörper nur mit dem Sekundärantikörper inkubiert, um ein falschpositives Signal auszuschließen.
Die Antikörper wurden im Immunoblot in folgenden Verdünnungen eingesetzt:
Antikörperbezeichnung Verdünnung
Calgranulin A (S100A8) 1:500
Calgranulin B (S100A9) 1:500
Calgranulin A/B (S100A8/A9) 1:500
P0301501 (S100A9) 1:15000
P0841202 (Reg3A) 1:15000
GAPDH 1:2500
RegIIIα/γ 1:500
Meerrettichperoxidase-gekoppelter Eselantikörper gegen Kaninchen IgG
1:10000
40 Trypsin-EDTA von der Zellkulturschale gelöst, in Medium aufgenommen und bei 300 x g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und anschließend 10 ml fetales Kälberserum mit 10% DMSO auf das Zellpellet gegeben und vorsichtig resuspendiert. Es wurden Aliquotes zu je 1 ml in Kryogefäßen angefertigt und diese in einem Isopropanolbad bei 80°C über Nacht eingefroren. Zur langfristigen Konservierung wurden die Zellen bei -150°C tiefgefroren.