Neben dem qualitativen oder quantitativen Nachweis bestimmter Proteine im Blutplasma sowie in Zell- und Gewebelysaten mittels SDS-PAGelelektrophorese, Western-Blotting, Bradford-Test, ELISA […] spielt die Detektion von Proteinen in Gewebeproben und auf subzelluläere Ebene in Zellen eine wichtige Rolle um erste Hinweise auf mögliche Proteinfunktionen zu erhalten. Einfache und wichtige Techniken zur histologischen Orientierung in Gewebeproben sind die Färbetechniken, zum Beispiel die auch in dieser Arbeit verwendete Hämatoxilin-Eosin-Färbung. Um einzelne Proteine in Geweben darzustellen werden häufig Immunomarkierungen durchgeführt und die Gewebeproben anschließend mikroskopiert (Bendayan 2000; Morisset 1997). Diesen Methoden gemein ist
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die Verwendung von Antikörpern, die das gesuchte Protein in den Gewebeproben binden. Um diese spezifische Protein-Antikörperbindung sichtbar zu machen, werden sekundäre Antikörper eingesetzt, welche an den primären Antikörper binden und diesen über histochemische Färbung im Durchlicht oder über Fluorophorkopplung in der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar machen. Die Lokalisation der Proteine ist bei diesen Methoden an die Auflösungsgrenzen photo-optischer Systeme gebunden. Eine sensitivere Methode zur Proteindetektion auf subzellulärer Ebene stellt die Immuno-Gold-Markierung dar. Zwar werden auch hier die gesuchten Proteine primär mit Antikörpern markiert, diese werden dann aber über Kopplung an Goldmoleküle elektronenmikroskopisch sichtbar gemacht (Bendayan 2000). In dieser Arbeit kamen einfache und verglgeichsweise material- und kostenextensive Immunfluoreszenzmarkierungen zum Einsatz. Neben der Fluoreszenz von antikörpergekoppelten Fluorophoren verfügen Zellen und Gewebe über natürliche Fluorophore, deren Lichtemission die Detektion der fluorophormarkierten Proteine überdecken kann. Die in dieser Arbeit verwendeten Pankreasgewebeproben wiesen einen unregelmäßigen, hohen Eigenfluoreszenzhintergund auf, so dass die Proben für eine sensitive, reproduzierbare Fluoreszenzmarkierung einer speziellen Gewebevorbereitung bedurften.
Hierauf soll im nächsten Abschnitt näher eingegangen werden.
1.4.1 Eigenfluoreszenz von Zellen und Geweben
Obwohl die Untersuchung, Beschreibung und Quantifizierung der Eigenfluoreszenz von formalinfixierten, paraffineingebetteten Pankreasgewebeproben nicht direkt zur Klärung der übergeordneten Fragestellung dieser Arbeit beitragen, war die aus ihrer Limitation begründete Qualität der wertvollen humanen Pankreasbiopsien Anlass genug, sich intensiv mit der Ursache der Eigenfluoreszenz dieser Präparate auseinanderzusetzten und adäquate Protokolle zu entwickeln, welche die Eigenfluoreszenz herabsetzen.
Eigenfluoreszenz ist die Eigenschaft von Stoffen, Zellen oder Geweben, Licht einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren und dann Licht einer längeren Wellenlänge wieder zu emittieren. Viele aromatische Verbindungen, Reaktionsprodukte einiger Aldehyde (Andersson 1998; Willingham 1983) sowie viele Azofarbstoffe (Romijn 1999) fluoreszieren, wenn sie mit Licht einer definierten Wellenlänge angeregt werden.
Bei der Immunfluoreszenz-Markierung bestimmter Proteine in Zellen oder Geweben kann Eigenfluoreszenz der Präparate die mikroskopische Auswertung erschweren, wenn sich die Wellenlänge der zur Markierung gewählten Fluorophore mit der Wellenlänge der emittierten Eigenfluoreszenz überschneidet. Eigenfluoreszenz kann dann die spezifische Fluoreszenz-Markierung gänzlich überlagern, sie kann falsch-positive spezifische Fluoreszenzmarkierung vortäuschen und sie kann die Auswertung durch ein schlechtes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis erschweren.
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Die Ursache für Eigenfluoreszenz können fluoreszierende Stoffe sein, die sich natürlicherweise in Zellen und Geweben befinden und demnach charakteristisch für bestimmte Gewebetypen sind. Die Eigenfluoreszenz des neuralen Gewebes entsteht zu großen Teilen durch das Alterspigment Lipofuszin (Schnell 1999). Durch die Reaktion der Malonaldehyd-Gruppe des Lipofuszin mit primären Aminen zu konjugierten Schiff’schen Basen entstehen fluoreszierende Stoffe (Andersson 1998; Willingham 1983). Auch Lebergewebe älterer Säuger weist einen hohen Anteil an Lipofuszin auf. Eine weitere natürliche Quelle für Fluorophore stellen Kollagen, Elastin und Muzine (Viegas 2007), sowie oxidierte Flavine, FAD, NADH/ NADPH (Andersson 1998; Benson 1979) dar. Sowohl die hohe Stoffwechselrate als auch die große Zahl an Blutgefäßen, welche Kollagen und Elastin enthalten, lassen Nierengewebe stark fluoreszieren. In histologischen Präparaten aller Gewebe findet sich stark fluoreszierende Porphyrine aus Erythrozyten (Romijn 1999).
Fluoreszierende Stoffe können aber auch prozessbedingt bei der Verarbeitung der Präparate entstehen. Bei der Gewebefixation mit Formaldehyd und Glutaraldehyd entstehen in großer Zahl stark fluoreszierende Verbindungen. Ähnlich wie beim Lipofuszin spielt auch hier die Reaktion von Aldehyden mit primären Aminen zu Schiff’schen Basen eine Rolle. Das Eosin der HE-Färbung, Toluidin Blau und andere Azofarbstoffe, die häufig als Standardfärbeverfahren eingesetzt werden, führen je nach Anregungswellenlänge zu intensiver Fluoreszenz (Romijn 1999).
Obwohl das Pankreas keine nennenswerten Lipofuszin-Einlagerungen und wenig Kollagen und Elastinfasern aufweist, ist die natürliche Eigenfluoreszenz des Pankreas ähnlich intensiv wie die von Niere und Leber (Viegas 2007). Vermutlich ist aufgrund der hohen Stoffwechselleistung, des Muzingehalts im Bauchspeichel und aufgrund der hoch konzentrierten Proteine und Enzyme in den Zymogengranula intensive Eigenfluoreszenz zu beobachten.
Die Beschreibung, also die Lokalisation und Intensitätsmessung, der Eigenfluoreszenz von Pankreasparenchym auf zellulärer und subzellulärer Ebene ist ein Teil dieser Arbeit geworden, weil eine Vielzahl unterschiedlicher Gewebeproben (unterschiedliche Herkunft, Spezies, Fixierungsprotokoll) alle durch eine intensive Eigenfluoreszenz auffiel und die Auswertung fluoreszenzmarkierter Gewebeproben unmöglich machte.
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2. Aufgabenstellung
Um eine zuverlässige, frühzeitige und differenzierte Diagnostik von Pankreaserkrankungen durchführen zu können ist es Ziel dieser Arbeit, Proteine zu finden, die nicht nur zufällig während der Pathogenese der Pankreaserkrankungen ins Blut gelangen wie beispielsweise Lipase, Amylase, CEA und CA19-9, sondern solche Proteine zu detektieren, die an der Pathogenese der Pankreaserkrankung essentiell beteiligt sind. Daher beschränkt sich diese Arbeit nicht darauf, Proteine im Blut zu detektieren, sondern vielmehr soll auch herausgefunden werden, wo und in welchem Maße diese Proteine bei Pankreatitis und bei Pankreasneoplasien detektiert werden können. Dabei wird die Theorie verfolgt, dass ein Protein, das essentielle Bedeutung bei der Entwicklung einer Erkrankung hat, auch zuverlässig und sensitiv in der Diagnostik verwendet werden kann. Ein Protein hingegen, welches nicht essentiell für die Entstehung einer Erkrankung ist, ist möglicherweise auch weniger zuverlässig für die Frühdiagnostik geeignet (CEA; CA19-9). Um dieses Ziel zu verfolgen wurden im Einzelnen folgende Fragestellungen bearbeitet:
Hühner sind mit Peptidsequenzen von humanen S100A9 und Reg3A-Proteinen vakziniert worden. Die von den Hühnern produzierten Antikörper sollten aus den Eiern isoliert werden.
Es sollte überprüft werden, ob die isolierten Antikörper ihre Epitope erkennen. Diese Antikörper sollten dann zur Detektion von S100A9 und Reg3A Proteinen im Western-Blot, in Pankreaskarzinom-Zelllinien und in humanem Gewebe mit verschiedenen Pankreaserkrankungen verwendet werden.
Parallel zur Detektion der S100A8/A9 und Reg3A Proteine im Blutplasma von Gesunden, von Patienten mit Chronischer Pankreatitis und von Patienten mit Duktalem Adenokarzinom sollten die Proteine auch in Biopsien von Patienten derselben Diagnosegruppen detektiert werden. Auf diese Weise sollte herausgefunden werden, ob erhöhte Blutplasmakonzentrationen zufällig koinzident mit den Pankreaserkrankungen auftreten, oder ob ein Kausalzusammenhang besteht. Weiterhin sollte überprüft werden, ob anhand der in humanen Gewebeproben festgestellten Lokalisation und Expression der Proteine, die bisher in der Literatur vor allem für Maus und Ratte beschrieben Funktionshypothesen bestätigt werden können.
Letztlich sollten Blutplasmakonzentrationen bereits zur Diagnostik von Pankreaserkrankungen etablierter Proteine wie CRP, CA19-9 und CEA mit den Konzentrationen von S100A8/A9 und Reg3A verglichen werden. In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob der S100A8/A9 Proteinkomplex sowie das Reg3A Protein potenziell zur Ergänzung der bereits etablieren Proteinmarker geeignet erscheinen. Es sollte der Ansatz verfolgt werden, dass die Kombination mehrerer unterschiedlicher im Blut detektierter Proteine eine sensitivere und spezifischere Differentialdiagnostik von Pankreaserkrankungen des Menschen ermöglicht.
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