Kovalente LbL-Immobilisierung auf Glasträgern

Die Aktivität aus Überstand (A1) und Waschfraktionen (A2) wird subtrahiert und durch die theoretische Aktivität (siehe Kapitel 9.5.3.2) dividiert. Die theoretische Aktivität gibt die maximal mögliche immobilisierte Aktivität an, davon ausgehend, dass sich durch die Immobilisierung kein Aktivitäts-verlust ergibt. Für die Trisoperl PMGK-Träger betrug diese _A = 41 %, es hat sich demnach ein Aktivitätsverlust von etwa 60 % ergeben.

Bei der Berechnung muss beachtet werden, dass sich bei Verwendung ho-her Enzymkonzentrationen für die Immobilisierung ein Fehler ergibt. Da nicht genügend Bindungsstellen auf dem Träger zur Verfügung stehen, liegt die Immobilisierungsausbeute in dem Fall immer < 100 %. Die niedrige Ak-tivitätsausbeute resultiert allerdings in der kovalenten Immobilisierungs-methode. Durch die kovalente Anbindung verliert ein Teil des Enzyms seine katalytische Aktivität, so dass nach einer kovalenten Immobilisierung nicht die gesamte Aktivität des freien Enzyms in immobilisierter Form wiederge-funden wird. Durch eine kovalente Immobilisierung können hohe Aktivi-tätsverluste bis zu einem kompletten Verlust an Aktivität auftreten [Cao 2005]. Die in der Literatur für die Immobilisate belegte Wiederverwend-barkeit konnte im Experiment bestätigt werden. Der zusätzliche, hohe Ver-lust an Aktivität vom ersten auf den zweiten Batch könnte seine Ursache in unzureichend gebundenem Enzym haben, welches durch Waschschritte nach der Immobilisierung nicht hinreichend entfernt wurde und sich wäh-rend des Versuchs vom Träger ablöst. In der Folge wird aus diesem Grund auch die adsorptive Immobilisierung auf den polyelektrolytbeschichteten Trägern untersucht, um zu ermitteln wie gut die Bindung an den Träger ohne Linkermolekül funktioniert.

3.1.2. Kovalente LbL-Immobilisierung auf Glasträgern

Von dem Projektpartner Surflay-Nanotec wurden poröse Glaspartikel Trisoperl PMGL L 05/11-Träger (Durchmesser 50 - 100 µm, Porendurch-messer 102,6 nm) mit LbL-Beschichtung unterschiedlicher Polyelektrolyte hergestellt und für die Enzymimmobilisierung zur Verfügung gestellt. Mit-hilfe der im vorangegangenen Kapitel dargestellten Methode wurden En-zyme immobilisiert und die Immobilisate auf Aktivität untersucht. Das Ziel bestand darin eine passende Polyelektrolyt-Beschichtung zu finden, welche eine hohe Aktivität und Stabilität der Immobilisate gewährleistet. Die LbL-Methode findet bei der Immobilisierung von Enzymen bisher keine Anwen-dung, so dass keine Literaturbeschreibungen zur Verfügung standen. In

Anbindungsmengen, die Lagerfähigkeit, Temperatur- und pH-Stabilität der Immobilisate ermittelt. In Tabelle 3-1 sind die unterschiedlichen Polyelekt-rolyt-Beschichtungen aufgeführt, es handelt sich um die Polyanionen: Poly-styrolsulfonat (PSS) und Polymethacrylamid (PMAA) und die Polykationen:

Polyethylenimin (PEI) und Polyallylamin-Hydrochlorid (PAH).

Tabelle 3-1: Von Projektpartner Surflay Nanotec nach der LbL-Methode beschich-tete poröse Trisoperl Glas-Träger (Bezeichnung: PMGK L 05/01) für die kovalente Immobilisierung mittels GDA.

Bezeichnung Beschichtung Aminogruppen/

Träger [mmol/g]

SHU 100 Amino-Silanisierte Referenzpartikel 1.1

SHU 201 PAH 15 000 0.32

Die Immobilisierung und die Aktivitätstests wurden alle nach der gleichen Methodik durchgeführt, so dass eine Vergleichbarkeit der Versuche unter-einander möglich ist (siehe auch 9.5.1 und 9.5.2). Zu allen beschichteten Trägern wurde nach der Aktivierung ein Überschuss an Enzym gegeben, so dass von einer maximalen Enzymanbindung ausgegangen werden kann.

Das Enzymaktivitätsscreening nach kovalenter Immobilisierung auf den un-terschiedlichen Polymerbeschichtungen ist im Folgenden dargestellt:

Abbildung 3–4: Immobilisierungs- und Aktivitätsausbeute ADH-´A`, mit modifizierten Trisoperl-Trägern von Surflay Nanotec, Bedingungen: 80 mM Aceto-phenon, 18 % V V^-1 Isopropanol, 1,0 mM NADH in KPi-Puffer (0,1 M,

pH 7,0), Reaktionsvolumen 10 mL, 30 °C, Immobilisierung von etwa 0,3 U mg^-1 Enzymträger.

Abbildung 3–5: Repetitive-Batch-Versuche mit Immobilisaten, Verwendung der ober-flächenmodifizierten Trisoperl Träger von Surflay Nanotec, 2 mL einer 10 % V V ^-1 Suspension der Träger in Wasser, Reaktionsbedingungen:

80 mM Acetophenon, 18 % V V^-1 Isopropanol, 1,0 mM NADH in KP_i -Puffer (0,1 M, pH 7,0), Reaktionsvolumen 10 mL, 30 °C.

Die Enzymimmobilisierung war auf allen modifizierten Trägern möglich (siehe Abbildung 3–4), die Ergebnisse sind jedoch sehr inhomogen. Die niedrigen Aktivitätsausbeuten weisen auf einen Aktivitätsverlust durch die Art der Immobilisierung hin. Die Immobilisierungsausbeute liegt für die meisten Träger sehr niedrig, dies hängt unter anderem mit der anfänglich eingesetzten, sehr hohen Menge an Enzymlösung zusammen, wodurch ein hoher Überschuss an Aktivität im Überstand resultierte.

Eine sehr hohe Immobilisierungsausbeute mit 97 % und einer Aktivitäts-ausbeute von 53 % weisen die SHU139 Partikel auf (Polyethyleniminbe-schichtung 25 000 Da). Diese Partikel zeigen im Batchversuch die höchste Aktivität in Units pro Gramm Träger. Die zweithöchste Aktivität und Immo-bilisierungsausbeute weisen die Referenzpartikel SHU100 (silanisierte Glaspartikel, Trisoperl) auf. Die Aminogruppendichte dieser Partikel ist dreimal so hoch wie die der Partikel SHU201, 301 und 136, deren gemes-sene Aktivität den Erwartungen entsprechend niedriger liegt, wobei die Aktivität auf den SHU136 Partikeln mit 7,1 U gTräger^-1 sehr gering ausfällt.

Insgesamt ist die nach der Immobilisierung auf den Trägern gemessene Ak-tivität sehr niedrig und die EnzymakAk-tivität im Überstand sehr hoch. Damit

51.8

Aktivität Immobilisat [U gTrisoperl-Träger-1]

oberflächenmodifizierte Trisoperl PMGK L 05/01 Träger 1. Batch

2. Batch

der Enzyme eignen. Da die Aktivierung und Immobilisierung mit Glutardial-dehyd eine etablierte Standardmethode für Träger mit Aminogruppen dar-stellt, kann davon ausgegangen werden, dass das Linkermolekül grundsätz-lich geeignet ist. Auffällig sind die Aktivitätsverluste im Repetitive-Batch Versuch (Abbildung 3–5), die zwischen 35 % und 63 % liegen und auf einen Verlust an Enzym hinweisen. Der Aktivitätsverlust wurde auch bei der Im-mobilisierung mit kommerziellen Trägern beobachtet (siehe Versuch 3.1.1) und ist mit einem Verlust an nicht hinreichend gebundenem Enzym zu er-klären. Eine weitere Erklärung könnte eine neben der kovalenten Anbin-dung zusätzlich auftretende adsorptive AnbinAnbin-dung von Enzymen sein. Vor und zwischen den einzelnen Versuchen wurde das Immobilisat mit Puffer gespült um lose oder schwach gebundene Enzyme zu entfernen und die Waschlösung auf Enzymaktivität untersucht, ohne dabei eine Ablösung von Enzymen zu messen. In weiteren Versuchen wurde deshalb untersucht, ob eine adsorptive Immobilisierung auf den Trägern überhaupt möglich ist.

Aufgrund des guten Ergebnisses mit den SHU139 Trägern (PEI-Beschichtung), wurden weitere Versuche zur Bestätigung der Ergebnisse mit PEI-beschichteten Trägern durchgeführt und es wurden Variationen der PEI-Beschichtung näher untersucht.