Aufarbeitung und Analyse von DNA

Es wurden entweder frisch isolierte Parasiten oder Parasiten, die als Pellet bei –80°C gelagert wurden, verwendet. Das Pellet mit den Parasiten wurde in 5 ml 0,1 M EDTA resuspendiert, 400 µl Proteinase K (20 mg/ml) und 5 ml Lysispuffer zugegeben, gut gemischt und 1-2 h bei 55°C inkubiert. Die Lösung wurde infolge der frei werdenden DNA sehr viskös. Danach wurde erneut frischer Lysispuffer und 200 µl Proteinase K zugegeben, leicht geschüttelt und 1 h bei 55°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Phenol-Chloroform-Extraktion zur Trennung von DNA und Proteinen.

3.2.4.2 DNA-Reinigung durch Phenol/Chloroform-Extraktion

Die Phenol/Chloroform-Extraktion dient dazu, Enzyme, wie z.B. Endonukleasen, nach einem Restriktionsverdau zu entfernen. Diese würden bei den nachfolgenden Reaktionen, wie Ligation und Transformation, stören. Dabei werden Proteine selektiv in die Phenolphase extrahiert und somit von der wässrigen DNA-Lösung getrennt.

Die DNA-Lösung wurde mit dem gleichen Volumen an Phenol versetzt, gemischt und zur Phasentrennung 5 min mit 15000 × g zentrifugiert. Die wässrige, obere Phase wurde

abgezogen und in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt. Die verbleibende organische Phase wurde mit einem Zehntel ihres Volumens re-extrahiert. Die wässrigen Phasen wurden vereint und zum Entfernen von Phenolresten mit Phenol/Chloroform (1:1) versetzt und anschließend mit Chloroform extrahiert. Dazu wurde die DNA-Lösung jeweils mit einem gleichen

Volumen Phenol/Chloroform bzw. Chloroform versetzt, gemischt und zentrifugiert.

Anschließend erfolgte eine Fällung mit Äthanol/Ammoniumacetat.

3.2.4.3 Fällen und Waschen von DNA

DNA-haltige Lösungen wurden mit einem Zehntel ihres Volumens an 3 M Natriumacetat (pH 5,5), sowie dem dreifachen Volumen an 96 %igen Äthanol versetzt, gemischt und 30 min bei –20°C stehen gelassen. Nach der Zentrifugation (30 min, 15000, 4°C) wurde der Überstand vorsichtig entfernt und das Pellet mit 70 %igem Äthanol gewaschen. Durch das Waschen wurden restliche Salze entfernt, welche nachfolgende Reaktionen stören könnten. Zur besseren Sichtbarkeit des DNA-Pellets nach der Zentrifugation wurde 1 µl Glykogen pro Ansatz beigegeben, so dass sich das Pellet in der Lösung hell weiß anfärbte und der Überstand sicherer abpipettiert werden konnte.

3.2.4.4 Elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten

DNA-Fragmente können durch Elektrophorese in Agarose-Gelen ihrer Größe entsprechend aufgetrennt werden, um Reaktionen wie PCR, Plasmidisolierung oder Restriktion zu

kontrollieren. Die DNA-Fragmente wurden im Gel nach Anfärbung mit dem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht. Der Größe der erwarteten Fragmente entsprechend, wurden 0,8-2,0 %ige Agarose-Gele angefertigt. Dazu wurde eine 1 × TAE-Puffer-Lösung mit Agarose (Endkonzentration 0,8-2,0 % w/v) gemischt

und kurz aufgekocht. Nach Abkühlung auf ca. 60°C wurde die Agarose als Horizontalgel mit eingehängtem Kamm gegossen. Als Laufpuffer wurde 1 × TAE-Puffer verwendet. Die DNA-Proben wurden vor dem Auftragen mit 1 × bzw. 10 × Farbmarker versetzt und dann neben einem DNA-Längenstandard in die Geltaschen pipettiert. Es wurde eine konstante Spannung zwischen 30 V und 65 V angelegt. Als Kontrolle für den Verlauf der Elektrophorese diente die Farbstoffbande des Probenpuffers. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in einer Ethidiumbromid-Lösung (2,5 ng/ml) 10 min gefärbt und in 1 × TAE-Puffer entfärbt.

3.2.4.5 Elution von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen

Um Fragmente aus Agarose-Gelen zu isolieren, wurden die entsprechenden DNA-Banden nach der elektrophoretischen Auftrennung mit einem sterilen Skalpell aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten und die DNA mit Hilfe des „QIAquick Gel Extraction Kits“

(Qiagen), gemäß den Angaben des Herstellers, eluiert und gereinigt. Anschließend wurde die DNA gefällt und gewaschen. Zur Kontrolle wurde ein Aliquot auf einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt.

3.2.4.6 Konzentrationsbestimmungen von DNA und RNA

Die Konzentration von DNA- und RNA-haltigen Lösungen wurde über

Absorptionsspektrometrie bestimmt. Bei DNA-haltigen Lösungen entspricht ein Extinktions-Koeffizient von 1 bei einer Wellenlänge von 260 nm einer Konzentration von etwa 50 ng/µl, bei RNA-haltigen Lösungen entspricht ein Extinktions-Koeffizient von 1 bei einer

Wellenlänge von 260 nm etwa 40 ng/µl. Für einzelsträngige Nukleinsäuren, wie z.B.

Oligonukleotide, entspricht ein Extinktions-Koeffizient von 1 etwa 33 ng/µl (Sambrook et al., 1989).

3.2.4.7 Restriktion von DNA

Doppelsträngige DNA wurde durch die Behandlung mit Restriktionsendonukleasen in Fragmente definierter Größe zerlegt. Anschließend wurde der Ansatz über eine Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Anhand des Bandenmusters konnte die verwendete DNA analysiert werden. Die Reaktionen erfolgten nach den Angaben des Herstellers unter Verwendung mitgelieferter Puffer bei den angegebenen optimalen Reaktionsbedingungen.

Analytischer Maßstab:

1-26 µl dsDNA (0,2-1 µg) 3 µl 10 × Inkubationspuffer 10 U Enzym

mit H2O bidest auf 30 µl auffüllen

Der Reaktionsansatz wurde ca. 2 h bei empfohlener Temperatur nach Angaben des Herstellers inkubiert. Anschließend wurden 3 µl 10 × Probenpuffer zugegeben und ein Aliquot auf einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt.

Präparativer Maßstab:

1-83 µl dsDNA (1-10 µg) 10 µl 10 × Inkubationspuffer

10-50 U Enzym

mit H2O bidest auf 100 µl auffüllen

Erneut wurde der Reaktionsansatz ca. 4 h bei empfohlener Temperatur inkubiert. Es folgte eine Phenol/Chloroform-Extraktion und Äthanol-Fällung. Zur Kontrolle der Restriktion wurde ein Aliquot auf einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt.

3.2.4.8 Dephosphorylierung von DNA

Um eine Religation linearisierter Plasmide zu vermeiden, wurden diese nach dem

Restriktionsansatz mit Alkalischer Phosphatase (Roche) nach den Angaben von Sambrook et al. (1989) behandelt. Die Inkubationsbedingungen hingen davon ab, ob die linearisierte DNA 5’-überhängende, 3’-überhängende oder glatte Enden besaß. Die Inaktivierung der

Alkalischen Phosphatase erfolgte durch Zugabe von EGTA auf eine Endkonzentration von 10 mM und nachfolgender Erwärmung des Reaktionsansatzes auf 75°C für 10 min. In der Regel wurde die Dephosphorylierung unmittelbar an den Restriktionsverdau angeschlossen. Nach der Dephosphorylierung erfolgte eine DNA-Reinigung über Phenol/Chloroform-Extraktion und Äthanol-Fällung.

3.2.4.9 Ligation von DNA

Die Konzentration von gereinigter Vektor- und Insertions-DNA wurden nach der analytischen Auftrennung im Agarose-Gel durch Vergleich der Bandenintensität bestimmt. Die Ligation erfolgte mit Hilfe der T4-DNA-Ligase (Roche) nach Angaben des mitgelieferten Protokolls.

Die Inkubation des Ligations-Ansatzes erfolgte über Nacht bei 4°C. Die ligierten Konstrukte wurden nach ihrer Transformation in E. coli-Zellen amplifiziert.