Erstellung eines S. cerevisiae-Gst/Flag markierten DPM1-Konstruktes

Dieses Konstrukt wurde zunächst in chemisch kompetente E. coli des XL blue Stammes transformiert und über einen Restriktionsverdau mit Eco RI und Sal I überprüft.

Da die Gst/Flag-Sequenz 777 bp trägt und das ScDPM1-Gen 828 bp groß ist, wurde ein Insert von 1605 bp erwartet.

Eine Schwierigkeit ergab sich bei der Restriktion mit Hpy 99I, Eco RI und Sal I auf Grund der Inkompatibilität der Puffersysteme dieser Enzyme, so dass der Verdau schrittweise

durchgeführt werden musste. Nach der Kontrolle auf dem Agarose-Gel wurde das Fragment ausgeschnitten und mittels Gel-Extraktion aufgereinigt. Während dieser Arbeitsschritte ging viel DNA verloren, so dass nach erneutem Verdau und Kontrolle mit der Gel-Elektrophorese nicht genügend DNA zur weiteren Klonierung vorlag.

Aus diesem Grunde wurden neue Schnittstellen für die Fragmente gewählt, deren Puffersysteme kompatibel waren.

Das Fragment Gst/Flag wurde mit Spe I und Xba I verdaut und in den pCR^®TOPO 2.1 Vektor kloniert. Aus dem ersten, oben beschriebenen Klonierungsversuch wurde mit Eco RI und Nhe I ein Fragment ausgeschnitten, welches das ScDPM1-Gen und die Flag –Sequenz beinhaltet. Da die Flag-Sequenz lediglich Bedeutung für die Antikörper-Bindung bei einem Western-Blot hat, ist das doppelte Vorliegen unbedenklich.

Die Nhe I-Schnittstelle ist mit Spe I kompatibel, so dass beide Fragmente auf diese Weise in den TOPO-Vektor ligiert werden konnten. Das Gen wurde in dem TOPO-Vektor sequenziert und kontrolliert.

Die Kassette wurde mit Eco RI und Sal I ausgeschnitten, in pRS 426 ligiert und mittels Restriktionsverdau kontrolliert.

Die Transformation in eine YPH99^- dpm His-Gal-Hefe-Übernachtkultur erfolgte unter den in Material und Methoden beschriebenen Bedingungen. Diese Hefekultur wächst nur auf

Galaktose-Nährböden, da der Promoter, der die DPM-Synthese kontrolliert, nur in

Anwesenheit von Galaktose aktiv ist. Auf Glukose-Agar ist der Promoter nicht aktiv, folglich ist weder GPI-Synthese möglich, noch können die DPM-abhängigen Proteinmodifikationen durchgeführt werden. Histidin dagegen kann endogen exprimiert werden, so dass die Kultur auch auf Histidin-Mangel-Agar Wachstum zeigt. Der Transformationsansatz wurde sowohl auf SGR-Agar ohne Histidin, auf SGR-Agar ohne Uracil und ohne Histidin als auch auf SD-Agar ohne Histidin ausplattiert. Alle mit dem pRS 426 Vektor transformierten Hefezellen wuchsen auf Galaktose-Selektivplatten ohne Uracil und auf Glukose-Nährböden, da der Galaktose-abhängige Promoter durch den endogenen DPM1-Promoter ersetzt wurde und somit unabhängig von dem angebotenen Medium aktiv ist.

4.3.2 Ausplattierung der transformierten konditional letalen Mutante auf Permissiv- und Nichtpermissiv-Nährböden

Abb. 42: Ausplattierungsschema der Hefekulturen

Dieses Schema wurde auf drei unterschiedlichen Nährböden getestet. SGR (Galaktose) ohne Histidinzusatz, SD (Glukose) ohne Histidinzusatz und SGR ohne Histidin und ohne

Tryptophan.

Abb. 43: Wachstum der Hefekulturen auf SGR-Agar ohne Histidin Wie erwartet wachsen alle Kulturen auf Galaktose-Agar ohne Histidin.

YPH 99

-His Gal DPM ScDPM1+Gst+Flag In pRS426

ScDPM1+Flag In pRS 426, TRP

Abb. 44: Wachstum der Hefekulturen auf SGR-Agar ohne Histidin und ohne Uracil Auf dem Uracil-Mangelagar wachsen lediglich die mit dem Hefevektor pRS426

transformierten Kulturen. Dieser Vektor enthält ein Gen zur Expression von Uracil, so dass die Kultur nicht auf Uracil im Agar angewiesen ist. Der Wildtyp YPH 99^--His-Gal-DPM dagegen hat keine endogene Uracil-Quelle und wächst daher nicht. Auf Histidin-Zufuhr über den Agar ist keine Kultur angewiesen, da der Wildtyp ein Histidin-Expressionsgen trägt.

Durch die Verwendung dieses Mangel-Agars ist folglich eine Selektion möglich.

Abb. 45: Wachstum der Hefekulturen auf SD-Agar ohne Histidin

Wie erwartet wächst der Hefe-Wildtyp YPH 99^- His-Gal-DPM nicht auf Glukose-Nährboden, da der Wildtyp einen Galaktose-sensitiven Promoter vor dem DPM-Gen trägt. Somit kann DPM nur in Anwesenheit von Galaktose im Medium gebildet werden und die Kultur wächst.

Auf Glukose-Agar ist der Promoter nicht aktiv, der Hefe fehlt DPM und sie zeigt kein Wachstum, da weder GPIs gebildet werden, noch Proteine N-glykosyliert oder O-mannosyliert werden.

In der transformierten Hefemutante wurde DPM unter der Kontrolle eines Methionin-Promoters exprimiert, welcher unabhängig von dem angebotenen Medium angeschaltet ist.

Somit ist die GPI-Biosynthese möglich und die Kultur wächst.

4.3.3 Nachweis des Gst/Flag markierten DPM1-Proteins von S. cerevisiae mittels Western Blot

Drei Klone der Hefekulturen mit Gst/Flag markiertem ScDPM1-Protein wurden auf SD-Agar ohne Histidin ausplattiert und in Übernachtkultur angeimpft. Mit Hilfe eines Western Blots gelang der Nachweis des markierten Proteins von 60 kDa. Dabei entsprechen 30 kDa

ScDPM1, 30 kDa Größe weist auch das Gst-Protein auf. Der Blot wurde nach den Angaben in dem Kapitel „Material und Methoden“ durchgeführt. Die Primärantikörperlösung enthielt einen Anti-Gst-Antikörper (Ziege) in einer Konzentration von 1:5000 in 10 % BSA und PBS Tween 20 0,05 %. Als Sekundärantikörper diente ein Anti-Ziege-Antikörper (Esel) in einer Konzentration von 1:50.000, ebenfalls in 10 % BSA und PBS Tween 20 0,05%.

Abb. 46: Western Blot von drei Klonen der Hefekultur mit Gst und Flag-markiertem ScDPM1-Protein.

Der Blot wurde mit Anti-Gst-Antikörper durchgeführt und die Chemolumineszenz-Lösung Extended Duration Substrate Super Signal® West Dura verwendet. Das gesuchte Protein, ScDPM1 mit Gst von insgesamt 60 kDa Größe wurde mit einem Pfeil markiert. Der Wildtyp zeigt keine Reaktion mit dem Antikörper, während die Klone 1-3 mehrere Banden aufweisen.

55 kDa 66 kDa 84 kDa Klon 1 Klon 2 Klon 3 Wildtyp

60 kDa