Konstruktion und Überprüfung von programmspezifischen transkriptionellen CFP-Reportergenen

Die programmspezifischen transkriptionellen CFP-Reportergene sind modular aufgebaut. Sie bestehen aus einer austauschbaren Promotorregion, dem Leserahmen für CFP und dem ADH1-Terminator. Vor dem CFP-Leserahmen befindet sich eine Sequenz, die für Ubiquitin codiert (UBI4), ein Codon für ein N-Degron (TAT = Y (Tyrosin)) und ein Linker, der die Effizienz des N-Degrons moduliert (Δk) (Abb. 2.24).

Dieses Ubi-Y-Δk-CFP-Gen, das für destabilisiertes CFP codiert, wird im Folgenden CFP genannt. Die Halbwertszeit der Fluoreszenz des destabilisierten CFP beträgt 5 min (Hackett et al., 2006).

Abb. 2.24: Konstruktion von programmspezifischen transkriptionellen CFP-Reportergenen

A) In pNC955 wurde mittels sequenzspezifischer Mutagenese eine NotI-Schnittstelle hinter das CFP-Startcodon eingeführt, wobei BHUM1639 entstand, in dem die Promotorregion über Acc65I- und NotI-Stellen ausgetauscht werden kann. Hierzu wurde ein FLO11(P)-Fragment (2980 bp) aus BHUM170, ein TCS-CYC1-Element (670 bp) aus BHUM164 und ein FRE-CYC1-Element (690 bp) aus BHUM212 mit flankierenden Acc65I- und NotI-Stellen amplifiziert, die dann in BHUM1639 ligiert wurden, wobei BHUM1702-1704 entstanden. Die Reportergene TCS-CFP, FRE-TCS-CFP, FUS1-CFP und FLO11-CFP wurden anschließend über Acc65I- und EcoRI-Stellen in das LEU2-basierte integrative Plasmid YIplac128 kloniert. B) Herstellung von 2⨯TCS-, 5⨯TCS- und ΔUAS-CFP-Reportergenen in YIplac128-basierten Plasmiden. Das 2⨯TCS-CYC1-Element (690 bp) aus BHUM175 und das 5⨯TCS-CYC1-Element (750 bp) aus BHUM172 wurden amplifiziert und in BHUM1716 ligiert, wobei BHUM1754 und BHUM1759 entstanden. Ein CYC1(ΔUAS)-Element (650 bp) wurde aus BHUM1176 amplifiziert und in BHUM1716 ligiert, wobei BHUM1773 entstand. Die *-gekennzeichneten Plasmide wurden für quantitative Messungen in Abschnitt 2.3.2 verwendet.

Das hier als Ausgangsplasmid verwendete, integrative pNC955 (Hackett et al., 2006), enthält den CFP-ORF und als Promotor die FUS1(P)-UAS ("upstream activation sequence") fusioniert mit der TATA-Box des CYC1-Promotors (455 bp) (Abb. 2.24A).

Das im Folgenden als FUS1-CFP bezeichnete Gen diente als konjugationsspezifisches Reportergen. Um Reportergene mit austauschbaren Promotorregionen zu erhalten, wurde mit Hilfe von sequenzspezifischer Mutagenese eine NotI-Schnittstelle in pNC955 direkt hinter das CFP-Startcodon eingeführt (Abb. 2.24A). Das Produkt dieser Mutagenese ist BHUM1639. Für die Konstruktion von biofilmspezifischen Reportergenen kann nun die Promotorregion von CFP durch einen Acc65I/NotI-Restriktionsverdau ausgetauscht werden. Biofilm-spezifische Reportergene enthalten sowohl FLO11(P), als auch einzelne TCS-Elemente oder FREs. Mit Hilfe von Primern, die jeweils am 5´-Ende des PCR-Produkts eine Acc65I- und am 3´-Ende eine NotI-Schnittstelle generierten, wurde ein FLO11(P)-Fragment (2980 bp) aus BHUM170 (Rupp et al., 1999), ein TCS-CYC1-Element (670 bp) aus BHUM164 und ein FRE-CYC1-Element (690 bp) aus BHUM212 (Madhani und Fink 1997) amplifiziert (Abb. 2.23A). Das TCS-CYC1-, das FRE-CYC1- Fragment und FLO11(P) wurden dann in das CFP-tragende BHUM1639 kloniert, wobei BHUM1702-1704 entstanden. Die Reportergene TCS-CYC1-CFP, FRE-CYC1-CFP und FLO11(P)-CFP werden nachfolgend TCS-CFP, FRE-CFP und FLO11-CFP genannt.

Da sich herausstellte, dass sich pNC955 nur schlecht in das Hefegenom integrieren ließ, wurden die beschriebenen Reportergene inklusive ADH1(T) über ihre Acc65I/EcoRI-Schnittstellen in das LEU2-basierende, integrative Plasmid YIplac128 umkloniert. Es entstanden BHUM1716 (TCS-CFP), BHUM1717 (FRE-CFP), BHUM1718 (FUS1-CFP) und BHUM1858 (FLO11-(FUS1-CFP) (Abb. 2.24A). Nach Verdau mit BstEII wurden die Plasmide in Hefestämme integriert, die bereits fluoreszenzmarkierte Versionen von Tec1 und/oder Ste12 trugen. Die Integration wurde mit Hilfe der Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer CFP-spezifischen Sonde verifiziert. Die Funktionalität der Reporter wurde anschließend im Fluoreszenzmikroskop überprüft.

Hierfür wurden die Hefestämme zuerst in LFM angezogen und dann Kulturschälchen mit Glasboden übertragen, in die ebenfalls LFM gegeben wurde. Die Kulturschälchen ermöglichen die mikroskopische Beobachtung von Zellen unter guten Nährstoffbedingungen, erlauben aber auch einen Wechsel des Mediums oder die Zugabe verschiedener Chemikalien. Lebende Zellen werden mit dem Lektin

Concanavalin A an den Glasboden der Schälchen gebunden, sodass sie zwar fixiert sind, aber keinen weiteren Manipulationen ausgesetzt sind. Nach 30-minütiger Inkubation der Zellen in den Kulturschälchen wurden je 2 µM α-Faktor oder Methanol als Kontrolle zugegeben und für 2 h inkubiert. Dann wurden die Zellen im Durchlicht (DIC) und im CFP-Kanal fotografiert. Es wurden je 6 Bilder pro Stamm und Bedingung aufgenommen, die mit dem Programm "ImageJ" quantifiziert wurden (Abb. 2.25).

Abb. 2.25: Vergleich verschiedener TCS-getriebener CFP-Reportergene und eines ΔUAS-Reporters unter vegetativen Bedingungen und unter Konjugationsbedingungen

Balkendiagramm der Transkriptionsaktvierung folgender Reportergene: TCS-CFP (YHUM1911), 2⨯TCS-CFP (YHUM1950) und ΔUAS-CFP (YHUM1972). Zellen aus LFM-Flüssigkulturen wurden in Mikroskopieschälchen übertragen und für 2 h ohne (– Pheromon) oder mit 1 µM α-Faktor (+ Pheromon) inkubiert und anschließend im Durchlicht (DIC) und im CFP-Kanal fotografiert. Die Fluoreszenz-Bilder wurden quantifiziert und der Hintergrund (Hefestamm ohne fluoreszenzmarkierte Proteine) subtrahiert. Die Werte sind Durchschnittswerte aus 6 Mikroskopie-Bildern mit je 20-50 Zellen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.

Um die Stärke der basalen Transkriptionsaktivierung des CYC1-Promotorelements zu bestimmen, wurde ein CFP-Reporter konstruiert, der ein CYC1(ΔUAS)-Element (650 bp) aus BHUM1176 enthält. Dieses Element wurde über die angefügten Acc65I- und NotI-Schnittstellen in BHUM1716 ligiert, wobei BHUM1773 entstand (Abb. 2.24B). Die basale Aktivierung dieses als ΔUAS-CFP bezeichneten Reportergens war sehr gering, sodass sie vernachlässigt werden konnte. Beim TCS-CFP-Reporter ist ein vergleichsweise schwaches Signal vorhanden, das sich auch bei pheromon-induziertem Tec1-Abbau nicht verändert. Aus diesem Grund wurden zusätzlich Reportergene konstruiert, die ein 2⨯TCS- oder ein 5⨯TCS-Element enthielten, was die Transkriptionsaktvierung erhöhen sollte. Hierfür wurde das 2⨯TCS-CYC1-Element (690 bp) aus BHUM175 und das 5⨯TCS-CYC1-Element (750 bp) aus BHUM172 amplifiziert, wobei 5´-Acc65I- und 3´-NotI-Schnittstellen angefügt wurden

(Abb. 2.24B). Die Promotorelemente wurden in BHUM1716 ligiert, in welchem sie das TCS-CYC1-Element ersetzten. Es entstanden BHUM1754 und BHUM1759. Mit dem 5⨯TCS-Element war keine Dynamik der CFP-Transkriptionsaktivierung zu beobachten (Daten nicht gezeigt). Beim 2⨯TCS-Element ist die CFP-Transkriptionsaktivierung fast doppelt so stark wie die des einzelnen TCS-Elements. Zudem kann man eine deutliche Abnahme der Transkription unter Pheromoneinwirkung beobachten (Abb. 2.25), weshalb nur dieser 2⨯TCS-Reporter für die weiteren Messungen verwendet wurde.

2.3.1.3 RFP- und YFP-Reportergene eignen sich nicht für die Analyse der Dynamik programmspezifischer Transkriptionsaktivierung

Ein weitere Möglichkeit zur Nutzung des in-vivo-Messsystems ist theoretisch die parallele Messung der Transkriptionsaktivierung zweier unterschiedlicher Reporter in derselben Zelle. Zu diesem Zweck wurden programmspezifische RFP-Reportergene generiert. RFP hat eine vergleichsweise lange Maturierungszeit, die für das hier verwendete, relativ hell leuchtende tagRFP-Monomer 200 min beträgt (Merzlyak et al., 2007). Das bisher zur Destabilisierung von CFP verwendete Ubi-Y-Δk-Abbausignal bewirkt einen schnellen Abbau des Proteins, sodass die fluoreszierenden Eigenschaften von RFP aufgrund der langen Maturierung vermutlich gar nicht erst ausgebildet werden können. Aus diesem Grund wurde mittels sequenzspezifischer Mutagenese das N-Degron (TAT = Y) durch ein Glutaminsäurecodon (GAA = E) ersetzt. Proteine mit dieser Modifikation sollten eine Halbwertszeit von 50 min haben (Hackett et al., 2006).

Zunächst wurden FUS1-CFP-ADH1(T) (1705 bp), TCS-CFP-ADH1(T) (1920 bp) und FRE-CFP-ADH1(T) (1990 bp) aus pNC955, BHUM1716 und BHUM1717 über Acc65I- und EcoRI-Schnittstellen in das URA3-basierende Plasmid YIplac211 kloniert, wobei BHUM1720-1722 entstanden (Abb. 2.26A). In diesen Plasmiden wurde dann mittels sequenzspezifischer Mutagenese eine BcuI-Schnittstelle vor dem ersten Codon von CFP generiert. Hierbei entstanden unter anderem BHUM1810 (FRE-CFP) und BHUM1811 (FUS1-CFP). Die Plasmide mit der BcuI-Stelle dienten als Matrize für die Mutagenese-PCR zur Umwandlung des Tyrosincodons in ein Glutaminsäurecodon.

Über BcuI/EcoRI-Schnittstellen wurde dann ein RFP-ADH1(T)-Fragment (905 bp) aus BHUM1719 in die Plasmide kloniert, wobei BHUM1723-BHUM1725 entstanden (Abb. 2.25A). Außerdem wurden ein 2⨯TCS-Element und ein ΔUAS-Element in BHUM1723 kloniert (BHUM1755 und BHUM1774).

Abb. 2.26: Konstruktion von programmspezifischen transkriptionellen RFP- und YFP-Reportergenen A) Strategie der Herstellung von programmspezifischen transkriptionellen RFP-Reportergenen. FUS1-CFP-ADH1(T) (1705 bp), TCS-CFP-ADH1(T) (1920 bp) und FRE-CFP-ADH1(T) (1990 bp) aus pNC955, BHUM1716 und BHUM1717 über Acc65I- und EcoRI-Schnittstellen in das URA3-basierende Plasmid YIplac211 kloniert, wobei BHUM1720-1722 entstanden. Mittels sequenzspezifischer Mutagenese wurde in diesen Plasmiden eine BcuI-Schnittstelle vor dem ersten Codon von CFP generiert. Hierbei entstanden unter anderem BHUM1810 (FRE-CFP) und BHUM1811 (FUS1-CFP). In BHUM1810 und BHUM1811 wurde anschließend mit sequenzspezifischer Mutagenese das Tyrosin-Codon hinter der UBI4-Sequenz (TAT=Y) durch ein Glutaminsäure-Codon (GAA=E) ersetzt.

Über die BcuI-/EcoRI-Stellen wurde dann ein RFP-ADH1(T)-Fragment (905 bp) aus BHUM1719 eingebracht. Es entstanden BHUM1723-BHUM1725. Außerdem wurde ein 2⨯TCS-Element und ein CYC1(ΔUAS)-Element jeweils in BHUM1723 kloniert, um BHUM1755 und BHUM1774 zu erhalten. B) Ein YFP-ADH(T)-Fragment wurde aus dem Plasmid pCM29-1 amplifiziert, wobei BcuI- und EcoRI-Schnittstellen angefügt wurden, über die das Fragment in BHUM1810 und BHUM1811 ligiert wurde. Zudem wurde in BHUM1860 das FRE-CYC1-Element durch das CYC1(ΔUAS)-Element ersetzt, wobei BHUM1861 entstand.

Nach Verdau mit EcoRV wurden die Plasmide in Hefestämme integriert, die bereits fluoreszenzmarkierte Versionen von Tec1 und/oder Ste12 und ein CFP-Reportergen trugen. Die Integration wurde mit Hilfe der Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer RFP-spezifischen Sonde überprüft.

Die experimentelle Überprüfung eines FUS1-RFP-Reporters unter Pheromon-einwirkung ergibt, dass die Reaktionszeit des im Vergleich zu dem FUS1-CFP-Reporter langsamer und seine Aktivierung schwächer war (Abb. 2.27A).

Abb. 2.27: Transkriptionsaktivierung von RFP- und YFP-Reportergenen unter vegetativen Bedingungen und Konjugationsbedingungen

A) Transkriptionsaktivierung von FUS1-Reportergenen in YHUM1957 (FUS1-CFP, FUS1-RFP). Die Werte sind Durchschnittswerte aus 10 Mikroskopie-Bildern mit je 20-50 Zellen. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. B) Transkriptionsaktivierung von FRE-CFP (YHUM1915) und FRE-YFP (YHUM1958). Für Details zum Versuchsablauf siehe Abb. 2.25. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung aus zwei unabhängigen Messungen.

Bei FUS1-CFP ist in diesem Funktionstest eine etwa 4-fache Aktivierung unter Pheromon zu beobachten, FUS1-RFP steigt nur ungefähr 1,3-fach an. Als direkter Vergleich zu CFP-Reportern in denselben Zellen sind RFP-Reportergene also ungeeignet.

Schließlich wurden YFP-Reportergene konstruiert, da das verwendete Citrine-YFP wie CFP eine ähnlich kurze Maturierungszeit von einigen Minuten hat (Nagai et al., 2002).

Ein YFP-ADH(T)-Fragment wurde aus pCM29-1 amplifiziert, wobei BcuI- und EcoRI-Schnittstellen angefügt wurden, über die das Fragment in die Zielplasmide BHUM1810 und BHUM1811 ligiert wurde (Abb. 2.26B). Es entstanden BHUM1859 (FRE-YFP) und BHUM1860 (FUS1-YFP). Parallel wurde in BHUM1860 das FRE-CYC1-Element durch das CYC1(ΔUAS)-Element ersetzt, wobei BHUM1861 entstand.

Die Überprüfung der Integration der YFP-Reportergene durch Southern-Hybridisierung war mit einer YFP-spezifischen Sonde nicht möglich, weil die CFP- und YFP-Leserahmen bis auf einige Basen in den Fluorophor-codierenden Regionen identisch sind. Die Verwendung einer URA3-spezifischen Sonde erbrachte auch kein eindeutiges

Ergebnis, da das URA3-Gen in den verwendeten Hefestämmen nicht deletiert ist, sondern sein Leserahmen durch eine Transposon-Insertion unterbrochen ist. Die URA3-Sonde hybridisierte vermutlich mit den genomischen URA3-Regionen und ein Doppel-Signal entstand, welches nicht von einer Mehrfachinsertion der Plasmide zu unterscheiden war. Das FRE-YFP-Reportergen verhielt sich bei der mikroskopischen Überprüfung nicht analog zum CFP-Reportergen (Abb. 2.27B), da seine Aktivierung unter Pheromon zu- statt abnahm, sodass die YFP-Reportergene für quantitative Messungen zunächst nicht weiter verwendet wurden.

2.3.2 Untersuchung der Signaltransduktionsdynamik des Fus3/Kss1-MAPK-Moduls unter vegetativen und unter Konjugationsbedingungen

2.3.2.1 Regulation von Tec1, Ste12, Dig1 und Dig2 und programmspezifischer