2. Material und Methoden
2.2. Methoden
2.2.1. Molekularbiologische Methoden
2.2.1.9. Klonierung
2.2.1.9.1. Spezifische DNA-Hydrolyse durch Restriktionsendonukleasen
Je 3 bis 5 µg isolierter Plasmid-DNA (Kpt. 2.2.1.12) bzw. PCR-Fragmente (Kpt. 2.2.1.5) wurden zur Generierung geeigneter 3‘- und 5‘-Enden mit Restriktionsendonukleasen, unter Verwendung der vom Hersteller (New England Biolabs, Ipswich, GB) empfohlenen Reaktionsbedingungen und Puffer, spezifisch hydrolysiert (= „verdaut“ bzw. „geschnitten“). Die im Einzelnen verwendeten Endonukleasen finden sich aufgelistet in Tabelle 2.2.2. Die Aufreinigung der
„geschnittenen“ und mittels Agarosegelelektrophorese isolierten DNA-Fragmente erfolgte mithilfe des Wizard Gel Clean-Up and Purification Systems (Promega, Madison, USA).
2.2.1.9.2. Generierung glatter DNA-Enden (Blunting)
Zur Herstellung glatter Enden (blunt ends) an DNA, die zuvor mit Endonukleasen
„geschnitten“ wurde, die klebrige Enden (sticky ends) erzeugen, wurde das Klenow-Fragment (= DNA-Polymerase I) der Firma NEB benutzt. Ein typischer Reaktionsansatz hierfür hatte folgende Zusammensetzung:
● „geschnittene“ DNA 1 µg in variablem Volumen
● NEB-Puffer 2 (10x konzentriert) 4 µL
● Klenow-Fragment (5 U * µL-1) 0,2 µL
● dNTPs (10 mM) 1 µL
● mqH2O ad. 40 µL
Die Ansätze wurden für jeweils 30 Minuten bei 25°C inkubiert und anschließend mithilfe des Wizard Gel Clean-Up and Purification Systems aufgereinigt.
2.2.1.9.3. Dephosphorylierung von Plasmid-DNA
Um durch Entfernung von terminalen Phosphatgruppen die Religation von Plasmidvektoren zu verhindern, wurde „geschnittene“, linearisierte Plasmid-DNA unter Verwendung des Enzyms Calf Intestinal alkaline Phosphatase (CIP) der Firma NEB dephosphoryliert. Ein typischer Reaktionsansatz hierfür hatte folgende Zusammensetzung:
● linearisierte Plasmid-DNA 1 µg in variablem Volumen
● NEB-Puffer 3 (10x konzentriert) 4 µL
● CIP (10 U * µL-1) 1 µL
● mqH2O ad. 40 µL
41
Die Ansätze wurden für jeweils 60 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend wiederum mithilfe des Wizard Gel Clean-Up and Purification Systems (Promega) aufgereinigt.
2.2.1.9.4. Ligation von DNA-Fragmenten
Zur Ligation von DNA-Fragmenten wurde das Enzym T4 DNA-Ligase von NEB verwendet. Ein allgemeiner Ligationsansatz hatte folgende Zusammensetzung:
● linearisierte, dephosphorylierte Plasmid-DNA 100 ng in variablem Volumen
● „geschnittenes“ Insertionsfragment Menge im Verhältnis 1:3 (Plasmid : Fragment)
● T4 Ligase Puffer (10x konzentriert) 1 µL
● T4 DNA-Ligase (400 CE U * µL-1) 0,5 µL
● mqH2O ad. 10 µL
Die Ligation erfolgte für ca. 24 Stunden bei 16°C. Anschließend wurden je 2 µL der Ligationsansätze zur Transformation elektrokompetenter Escherichia coli Zellen verwendet (s.u.).
2.2.1.9.5. Klonierung der in der Arbeit verwendeten Plasmidvektoren
In Tabelle 2.2.2 sind die individuellen Klonierungsschritte, die für die Generierung der verwendeten Plasmidvektoren notwendig waren, zusammengefasst. Für welche Versuche die fertigen Expressionsvektoren genutzt wurden, kann dagegen der Tabelle 2.1.4 entnommen werden.
42
Tabelle 2.2.2 Zusammenfassung der individuellen Klonierungsschritte zur Generierung der in der Arbeit verwendeten Plasmidvektoren.
Ausgangs-Plasmid oder Template für
Amplifikation mittels PCR
PCR-amplifiziert mit Oligonukleotiden (Sequenzen siehe Tabelle 2.1.5)
Verdau mit Restriktions- endonuklease
Blunting mit Klenow- Fragment
ligiert mit
fertiger Expressionsvektor, Zwischen-Plasmid oder Fragment
pFGC_G-rb
EXFP_F-BamH1
BamHI - - mCherry_nost
mCherry_nost_r
pJR1138 - BamHI - mCherry_nost pJR1138-mCherry_nost
genomische Hefe-DNA (Wildtyp W303-1A)
ScTLG1p_f
XmaI + XhoI - - ScTLG1_stop
ScTLG1p_r genomische Hefe-DNA
(Wildtyp W303-1A)
ScSED5p_f
XmaI + XhoI - - ScSED5_stop
ScSED5p_r genomische Hefe-DNA
(Wildtyp W303-1A)
ScGOS1p_f
XmaI + XhoI - - ScGOS1_stop
ScGOS1p_r genomische Hefe-DNA
(Wildtyp W303-1A)
ScPEP12_f
XmaI + XhoI - - ScPEP12_stop
ScPEP12_r
pJR1138-mCherry_nost - XhoI + XmaI - ScTLG1_stop pJR1138-mCherry-ScTLG1
pJR1138-mCherry_nost - XhoI + XmaI - ScSED5_stop pJR1138-mCherry-ScSED5
pJR1138-mCherry_nost - XhoI + XmaI - ScGOS1_stop pJR1138-mCherry-ScGOS1
pJR1138-mCherry_nost - XhoI + XmaI - ScPEP12_stop pJR1138-mCherry-ScPEP12
pART7 - BamHI - mCherry_nost pART7-mCherry_nost
43
Ausgangs-Plasmid oder Template für
Amplifikation mittels PCR
PCR-amplifiziert mit Oligonukleotiden
Verdau mit Restriktions- endonuklease
Blunting mit Klenow- Fragment
ligiert mit
fertiger Expressionsvektor, Zwischen-Plasmid oder Fragment
A. thaliana (Col-0) cDNA
AtSYP61_f
XbaI - - AtSYP61_stop
AtSYP61_r
pART7-mCherry_nost - XbaI - AtSYP61_stop pART7-mCherry-AtSYP61
pART7-mCherry-AtSYP61 - NotI - - 35S::mCherry-AtSYP61-Tocs
pBART - NotI -
35S::mCherry-AtSYP61-Tocs pBART-mCherry-AtSYP61
pYES2-PACT1::mt_pHLuorin - BamHI + EcoRI ja - pHLuorin_blunt
pJR1138 - BamHI ja pHLuorin_blunt pJR1138-pHLuorin
pART7-EYFP
EYFP_SalI_F
SalI - - EYFP_stop
EYFP_SalI_R_STOP
pART7-EYFP
EXFP_F-BamH1
BamHI - - EYFP_nost
EYFP_R_nost_BamHI
pART7-EYFP - NotI - - 35S::EYFP-Tocs
pYES2-TaLCT1
LCT1_Xma1_F
- -
pGEM®-T mittels TA-Klonierung (Kpt. 2.2.1.8)
pGEM-TaLCT1_stop TaLCT1_R_XmaI_STOP
pYES2-TaLCT1
LCT1_Xma1_F
XmaI - - TaLCT1_nost
LCT1_Xma1_R
pGEM-TaLCT1_stop - XmaI - - TaLCT1_stop
44
Ausgangs-Plasmid oder Template für
Amplifikation mittels PCR
PCR-amplifiziert mit Oligonukleotiden
Verdau mit Restriktions- endonuklease
Blunting mit Klenow- Fragment
ligiert mit
fertiger Expressionsvektor, Zwischen-Plasmid oder Fragment
pART7 - XmaI - TaLCT1_stop pART7-TaLCT1
pART7-TaLCT1 - NotI - - 35S::TaLCT1-Tocs
pBART - NotI - 35S::TaLCT1-Tocs pBART-TaLCT1
pBART - NotI - 35S::EYFP-Tocs pBART-EYFP
pART7-EYFP - XmaI - TaLCT1_nost pART7-TaLCT1-EYFP
pUBI-AB - XmaI - TaLCT1_stop pUBI-AB-TaLCT1_stop
pUBI-AB-TaLCT1_stop
pmUBI-MCS_f
NotI + XbaI - - pmUbi-MCS-TaLCT1_stop
pmUBI-MCS_st_r
pUBI-AB-TaLCT1_stop - SfiI - - mUbi::TaLCT1-Tnos
pLH7000 - SfiI - mUbi::TaLCT1-Tnos pLH7000-TaLCT1
pYES2 - NotI + XbaI -
pmUbi-MCS-TaLCT1_stop pYES2-pmUbi-MCS-TaLCT1_stop
pYES2-pmUbi-MCS-TaLCT1_stop - XmaI - TaLCT1 entfernt und
Plasmid religiert pYES2-pmUbi-MCS-TAG
pYES2-pmUbi-MCS-TAG - XmaI - TaLCT1_stop pYES2-pmUbi-MCS-TaLCT1_stop-TAG
pYES2-pmUbi-MCS-TAG - XmaI - TaLCT1_nost pYES2-pmUbi-MCS-TaLCT1_nost-TAG
pYES2-pmUbi-MCS-TaLCT1_stop-TAG - BamHI - EYFP_nost pYES2-EYFP-TaLCT1
45
Ausgangs-Plasmid oder Template für
Amplifikation mittels PCR
PCR-amplifiziert mit Oligonukleotiden
Verdau mit Restriktions- endonuklease
Blunting mit Klenow- Fragment
ligiert mit
fertiger Expressionsvektor, Zwischen-Plasmid oder Fragment
pYES2-pmUbi-MCS-TaLCT1_nost-TAG - SalI - EYFP_stop pYES2-TaLCT1-EYFP
pART7-EYFP
EXFP_F-BamH1
BamHI ja - EYFP_stop_blunt
EXFP_R-BamH1
pGEM-TaLCT1_stop - SmaI - - TaLCT1_stop_blunt
pART7-TaLCT1-EYFP - EcoRI + XbaI ja - TaLCT1-EYFP_blunt
pYES2-EYFP-TaLCT1 - KpnI + XbaI ja - EYFP-TaLCT1_blunt
pER8 - AscI + PacI ja EYFP_stop_blunt pER8-XVE-EYFP
pER8 - AscI + PacI ja TaLCT1_stop_blunt pER8-XVE-TaLCT1
pER8 - AscI + PacI ja TaLCT1-EYFP_blunt pER8-XVE-TaLCT1-EYFP
pER8 - AscI + PacI ja EYFP-TaLCT1_blunt pER8-XVE-EYFP-TaLCT1
pART7-TaLCT1-EYFP - NotI - 35S::TaLCT1-EYFP-Tocs
pBART - NotI -
35S::TaLCT1-EYFP-Tocs pBART-TaLCT1-EYFP
pUBI-AB - SalI - EYFP_stop pUBI-AB-EYFP
pUBI-AB-EYFP - XmaI - TaLCT1_nost pUBI-AB-TaLCT1-EYFP
pYES2-TaLCT1-EYFP - XmaI - TaLCT1 entfernt und
Plasmid religiert pYES2-EYFP
46
Ausgangs-Plasmid oder Template für
Amplifikation mittels PCR
PCR-amplifiziert mit Oligonukleotiden
Verdau mit Restriktions- endonuklease
Blunting mit Klenow- Fragment
ligiert mit
fertiger Expressionsvektor, Zwischen-Plasmid oder Fragment
Gerste (Golden Promise) cDNA
HvLCT2f_BamHI
- -
pGEM®-T mittels TA-Klonierung (Kpt. 2.2.1.8)
pGEM-HvLCT2_stop HvLCT2r_EcoRI_ST
pGEM-HvLCT2_stop - BamHI + EcoRI - - HvLCT2_stop
pYES2 - BamHI + EcoRI - HvLCT2_stop pYES2-HvLCT2
pGEM-HvLCT2_stop
HvLCT2f_BamHI
BamHI + EcoRI - - HvLCT2_nost
HvLCT2_EcoRI_nost
pUBI-AB-EYFP - BamHI + EcoRI - HvLCT2_nost pUBI-AB-HvLCT2-EYFP
pYES2-pmUbi-MCS-TAG - BamHI + EcoRI - HvLCT2_nost pYES2-pmUbi-MCS-HvLCT2(nost)-TAG
pYES2-pmUbi-MCS-HvLCT2(nost)-TAG - SalI - EYFP_stop pYES2-HvLCT2-EYFP
HvLCT2_nost - - ja - HvLCT2_nost_blunt
pART7-EYFP - SmaI - HvLCT2_nost_blunt pART7-HvLCT2-EYFP
pART7-HvLCT2-EYFP - NotI - - 35S::HvLCT2-EYFP-Tocs
pBART - NotI -
35S::HvLCT2-EYFP-Tocs pBART-HvLCT2-EYFP
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