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2. Material und Methoden

2.2. Methoden

2.2.1. Molekularbiologische Methoden

2.2.1.9. Klonierung

2.2.1.9.1. Spezifische DNA-Hydrolyse durch Restriktionsendonukleasen

Je 3 bis 5 µg isolierter Plasmid-DNA (Kpt. 2.2.1.12) bzw. PCR-Fragmente (Kpt. 2.2.1.5) wurden zur Generierung geeigneter 3‘- und 5‘-Enden mit Restriktionsendonukleasen, unter Verwendung der vom Hersteller (New England Biolabs, Ipswich, GB) empfohlenen Reaktionsbedingungen und Puffer, spezifisch hydrolysiert (= „verdaut“ bzw. „geschnitten“). Die im Einzelnen verwendeten Endonukleasen finden sich aufgelistet in Tabelle 2.2.2. Die Aufreinigung der

„geschnittenen“ und mittels Agarosegelelektrophorese isolierten DNA-Fragmente erfolgte mithilfe des Wizard Gel Clean-Up and Purification Systems (Promega, Madison, USA).

2.2.1.9.2. Generierung glatter DNA-Enden (Blunting)

Zur Herstellung glatter Enden (blunt ends) an DNA, die zuvor mit Endonukleasen

„geschnitten“ wurde, die klebrige Enden (sticky ends) erzeugen, wurde das Klenow-Fragment (= DNA-Polymerase I) der Firma NEB benutzt. Ein typischer Reaktionsansatz hierfür hatte folgende Zusammensetzung:

● „geschnittene“ DNA 1 µg in variablem Volumen

● NEB-Puffer 2 (10x konzentriert) 4 µL

● Klenow-Fragment (5 U * µL-1) 0,2 µL

● dNTPs (10 mM) 1 µL

● mqH2O ad. 40 µL

Die Ansätze wurden für jeweils 30 Minuten bei 25°C inkubiert und anschließend mithilfe des Wizard Gel Clean-Up and Purification Systems aufgereinigt.

2.2.1.9.3. Dephosphorylierung von Plasmid-DNA

Um durch Entfernung von terminalen Phosphatgruppen die Religation von Plasmidvektoren zu verhindern, wurde „geschnittene“, linearisierte Plasmid-DNA unter Verwendung des Enzyms Calf Intestinal alkaline Phosphatase (CIP) der Firma NEB dephosphoryliert. Ein typischer Reaktionsansatz hierfür hatte folgende Zusammensetzung:

● linearisierte Plasmid-DNA 1 µg in variablem Volumen

● NEB-Puffer 3 (10x konzentriert) 4 µL

● CIP (10 U * µL-1) 1 µL

● mqH2O ad. 40 µL

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Die Ansätze wurden für jeweils 60 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend wiederum mithilfe des Wizard Gel Clean-Up and Purification Systems (Promega) aufgereinigt.

2.2.1.9.4. Ligation von DNA-Fragmenten

Zur Ligation von DNA-Fragmenten wurde das Enzym T4 DNA-Ligase von NEB verwendet. Ein allgemeiner Ligationsansatz hatte folgende Zusammensetzung:

● linearisierte, dephosphorylierte Plasmid-DNA 100 ng in variablem Volumen

● „geschnittenes“ Insertionsfragment Menge im Verhältnis 1:3 (Plasmid : Fragment)

● T4 Ligase Puffer (10x konzentriert) 1 µL

● T4 DNA-Ligase (400 CE U * µL-1) 0,5 µL

● mqH2O ad. 10 µL

Die Ligation erfolgte für ca. 24 Stunden bei 16°C. Anschließend wurden je 2 µL der Ligationsansätze zur Transformation elektrokompetenter Escherichia coli Zellen verwendet (s.u.).

2.2.1.9.5. Klonierung der in der Arbeit verwendeten Plasmidvektoren

In Tabelle 2.2.2 sind die individuellen Klonierungsschritte, die für die Generierung der verwendeten Plasmidvektoren notwendig waren, zusammengefasst. Für welche Versuche die fertigen Expressionsvektoren genutzt wurden, kann dagegen der Tabelle 2.1.4 entnommen werden.

42

Tabelle 2.2.2 Zusammenfassung der individuellen Klonierungsschritte zur Generierung der in der Arbeit verwendeten Plasmidvektoren.

Ausgangs-Plasmid oder Template für

Amplifikation mittels PCR

PCR-amplifiziert mit Oligonukleotiden (Sequenzen siehe Tabelle 2.1.5)

Verdau mit Restriktions- endonuklease

Blunting mit Klenow- Fragment

ligiert mit

fertiger Expressionsvektor, Zwischen-Plasmid oder Fragment

pFGC_G-rb

EXFP_F-BamH1

BamHI - - mCherry_nost

mCherry_nost_r

pJR1138 - BamHI - mCherry_nost pJR1138-mCherry_nost

genomische Hefe-DNA (Wildtyp W303-1A)

ScTLG1p_f

XmaI + XhoI - - ScTLG1_stop

ScTLG1p_r genomische Hefe-DNA

(Wildtyp W303-1A)

ScSED5p_f

XmaI + XhoI - - ScSED5_stop

ScSED5p_r genomische Hefe-DNA

(Wildtyp W303-1A)

ScGOS1p_f

XmaI + XhoI - - ScGOS1_stop

ScGOS1p_r genomische Hefe-DNA

(Wildtyp W303-1A)

ScPEP12_f

XmaI + XhoI - - ScPEP12_stop

ScPEP12_r

pJR1138-mCherry_nost - XhoI + XmaI - ScTLG1_stop pJR1138-mCherry-ScTLG1

pJR1138-mCherry_nost - XhoI + XmaI - ScSED5_stop pJR1138-mCherry-ScSED5

pJR1138-mCherry_nost - XhoI + XmaI - ScGOS1_stop pJR1138-mCherry-ScGOS1

pJR1138-mCherry_nost - XhoI + XmaI - ScPEP12_stop pJR1138-mCherry-ScPEP12

pART7 - BamHI - mCherry_nost pART7-mCherry_nost

43

Ausgangs-Plasmid oder Template für

Amplifikation mittels PCR

PCR-amplifiziert mit Oligonukleotiden

Verdau mit Restriktions- endonuklease

Blunting mit Klenow- Fragment

ligiert mit

fertiger Expressionsvektor, Zwischen-Plasmid oder Fragment

A. thaliana (Col-0) cDNA

AtSYP61_f

XbaI - - AtSYP61_stop

AtSYP61_r

pART7-mCherry_nost - XbaI - AtSYP61_stop pART7-mCherry-AtSYP61

pART7-mCherry-AtSYP61 - NotI - - 35S::mCherry-AtSYP61-Tocs

pBART - NotI -

35S::mCherry-AtSYP61-Tocs pBART-mCherry-AtSYP61

pYES2-PACT1::mt_pHLuorin - BamHI + EcoRI ja - pHLuorin_blunt

pJR1138 - BamHI ja pHLuorin_blunt pJR1138-pHLuorin

pART7-EYFP

EYFP_SalI_F

SalI - - EYFP_stop

EYFP_SalI_R_STOP

pART7-EYFP

EXFP_F-BamH1

BamHI - - EYFP_nost

EYFP_R_nost_BamHI

pART7-EYFP - NotI - - 35S::EYFP-Tocs

pYES2-TaLCT1

LCT1_Xma1_F

- -

pGEM®-T mittels TA-Klonierung (Kpt. 2.2.1.8)

pGEM-TaLCT1_stop TaLCT1_R_XmaI_STOP

pYES2-TaLCT1

LCT1_Xma1_F

XmaI - - TaLCT1_nost

LCT1_Xma1_R

pGEM-TaLCT1_stop - XmaI - - TaLCT1_stop

44

Ausgangs-Plasmid oder Template für

Amplifikation mittels PCR

PCR-amplifiziert mit Oligonukleotiden

Verdau mit Restriktions- endonuklease

Blunting mit Klenow- Fragment

ligiert mit

fertiger Expressionsvektor, Zwischen-Plasmid oder Fragment

pART7 - XmaI - TaLCT1_stop pART7-TaLCT1

pART7-TaLCT1 - NotI - - 35S::TaLCT1-Tocs

pBART - NotI - 35S::TaLCT1-Tocs pBART-TaLCT1

pBART - NotI - 35S::EYFP-Tocs pBART-EYFP

pART7-EYFP - XmaI - TaLCT1_nost pART7-TaLCT1-EYFP

pUBI-AB - XmaI - TaLCT1_stop pUBI-AB-TaLCT1_stop

pUBI-AB-TaLCT1_stop

pmUBI-MCS_f

NotI + XbaI - - pmUbi-MCS-TaLCT1_stop

pmUBI-MCS_st_r

pUBI-AB-TaLCT1_stop - SfiI - - mUbi::TaLCT1-Tnos

pLH7000 - SfiI - mUbi::TaLCT1-Tnos pLH7000-TaLCT1

pYES2 - NotI + XbaI -

pmUbi-MCS-TaLCT1_stop pYES2-pmUbi-MCS-TaLCT1_stop

pYES2-pmUbi-MCS-TaLCT1_stop - XmaI - TaLCT1 entfernt und

Plasmid religiert pYES2-pmUbi-MCS-TAG

pYES2-pmUbi-MCS-TAG - XmaI - TaLCT1_stop pYES2-pmUbi-MCS-TaLCT1_stop-TAG

pYES2-pmUbi-MCS-TAG - XmaI - TaLCT1_nost pYES2-pmUbi-MCS-TaLCT1_nost-TAG

pYES2-pmUbi-MCS-TaLCT1_stop-TAG - BamHI - EYFP_nost pYES2-EYFP-TaLCT1

45

Ausgangs-Plasmid oder Template für

Amplifikation mittels PCR

PCR-amplifiziert mit Oligonukleotiden

Verdau mit Restriktions- endonuklease

Blunting mit Klenow- Fragment

ligiert mit

fertiger Expressionsvektor, Zwischen-Plasmid oder Fragment

pYES2-pmUbi-MCS-TaLCT1_nost-TAG - SalI - EYFP_stop pYES2-TaLCT1-EYFP

pART7-EYFP

EXFP_F-BamH1

BamHI ja - EYFP_stop_blunt

EXFP_R-BamH1

pGEM-TaLCT1_stop - SmaI - - TaLCT1_stop_blunt

pART7-TaLCT1-EYFP - EcoRI + XbaI ja - TaLCT1-EYFP_blunt

pYES2-EYFP-TaLCT1 - KpnI + XbaI ja - EYFP-TaLCT1_blunt

pER8 - AscI + PacI ja EYFP_stop_blunt pER8-XVE-EYFP

pER8 - AscI + PacI ja TaLCT1_stop_blunt pER8-XVE-TaLCT1

pER8 - AscI + PacI ja TaLCT1-EYFP_blunt pER8-XVE-TaLCT1-EYFP

pER8 - AscI + PacI ja EYFP-TaLCT1_blunt pER8-XVE-EYFP-TaLCT1

pART7-TaLCT1-EYFP - NotI - 35S::TaLCT1-EYFP-Tocs

pBART - NotI -

35S::TaLCT1-EYFP-Tocs pBART-TaLCT1-EYFP

pUBI-AB - SalI - EYFP_stop pUBI-AB-EYFP

pUBI-AB-EYFP - XmaI - TaLCT1_nost pUBI-AB-TaLCT1-EYFP

pYES2-TaLCT1-EYFP - XmaI - TaLCT1 entfernt und

Plasmid religiert pYES2-EYFP

46

Ausgangs-Plasmid oder Template für

Amplifikation mittels PCR

PCR-amplifiziert mit Oligonukleotiden

Verdau mit Restriktions- endonuklease

Blunting mit Klenow- Fragment

ligiert mit

fertiger Expressionsvektor, Zwischen-Plasmid oder Fragment

Gerste (Golden Promise) cDNA

HvLCT2f_BamHI

- -

pGEM®-T mittels TA-Klonierung (Kpt. 2.2.1.8)

pGEM-HvLCT2_stop HvLCT2r_EcoRI_ST

pGEM-HvLCT2_stop - BamHI + EcoRI - - HvLCT2_stop

pYES2 - BamHI + EcoRI - HvLCT2_stop pYES2-HvLCT2

pGEM-HvLCT2_stop

HvLCT2f_BamHI

BamHI + EcoRI - - HvLCT2_nost

HvLCT2_EcoRI_nost

pUBI-AB-EYFP - BamHI + EcoRI - HvLCT2_nost pUBI-AB-HvLCT2-EYFP

pYES2-pmUbi-MCS-TAG - BamHI + EcoRI - HvLCT2_nost pYES2-pmUbi-MCS-HvLCT2(nost)-TAG

pYES2-pmUbi-MCS-HvLCT2(nost)-TAG - SalI - EYFP_stop pYES2-HvLCT2-EYFP

HvLCT2_nost - - ja - HvLCT2_nost_blunt

pART7-EYFP - SmaI - HvLCT2_nost_blunt pART7-HvLCT2-EYFP

pART7-HvLCT2-EYFP - NotI - - 35S::HvLCT2-EYFP-Tocs

pBART - NotI -

35S::HvLCT2-EYFP-Tocs pBART-HvLCT2-EYFP

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