Hefeversuche

53 2.2.2.5. Arabidopsis-Transformation

Die Transformation von 5 bis 6 Wochen alten, unter Gewächshausbedingungen gewachsenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen (Ökotyp: Col-0) wurde nach der Floral-Dip Methode durchgeführt (Clough & Bent, 1998). Von den Pflanzen wurden nach etwa drei Wochen im Gewächshaus erste Blütenstände entfernt, um die verstärkte Bildung weiterer Infloreszenzen zu provozieren. Am Tag der Transformation wurden Schoten und bereits geöffnete Blüten mit einer Schere von den Pflanzen entfernt.

Eine mittels PCR getestete Agrobacterium tumefaciens-Kolonie, die die gewünschten Genkonstrukte trug, wurde von einer YEB-Selektionsplatte in 50 µL sterilem Wasser resuspendiert. Die so hergestellte Bakteriensuspension wurde wiederum auf eine neue YEB-Selektionsplatte ausplattiert und für zwei Tage bei 28°C inkubiert. Von der dicht bewachsenen Platte wurden die Bakterien mit einem Laborspatel abgenommen und in 20 mL YEB-Flüssigmedium bis zu einer OD600 von 3,0 resuspendiert. Die Suspension wurde anschließend zu weiteren 300 mL Wasser (mit 5% Saccharose und 0,03% Silwet L77) gegeben. Die vorbereiteten Arabidopsis-Pflanzen wurden nun für 30 bis 60 Sekunden in die Bakteriensuspension getaucht.

Daraufhin wurden die Pflanzen für weitere 4 bis 6 Wochen bis zur Samenreife im Gewächshaus kultiviert.

Samen transformierter Pflanzen wurden geerntet und auf Hygromycin B-haltigen Selektionsplatten (½ MS-Agarplatten (0,8% Phytoagar) + 20 µg * mL^-1 Hygromycin B) ausgesät. Nach 7 bis 10 Tagen waren untransformierte Keimlinge abgestorben. Die überlebenden Keimlinge wurden vorsichtig auf Erde umgesetzt. Nach weiteren 2 bis 3 Wochen Wachstum im Gewächshaus wurde Blattmaterial von den Pflanzen entnommen, DNA isoliert und in einer anschließenden PCR der Erfolg der Transformation überprüft. Erfolgreich transformierte Pflanzen wurden für die Vermehrung weitergeführt, nicht transformierte wurden verworfen.

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gleichen Medium wie die Starterkultur, mit dem Unterschied, dass Galaktose als Kohlenstoffquelle verwendet wurde. Die Galaktose bewirkt in den Hefen die Induktion des auf dem pYES2-Plasmid einklonierten Gens durch den GAL1-Promoter dieses Plasmids.

Nach einer weiteren 6 bis 8 stündigen Inkubation (30°C, 150 - 180 UPM) wurde erneut die Zelldichte der Kultur bestimmt und diese mit sterilem mqH2O auf exakt 1 * 10⁷ Zellen pro mL verdünnt. Von dieser Verdünnung wurden anschließend 3 weitere Verdünnungen mit mqH2O hergestellt (1:10; 1:100; 1:1000). Für die Wachstumsversuche wurden von jeder der vier Zellverdünnungen je 10 µL auf entsprechende Selektionsagarplatten (+ Galaktose) pipettiert. Sollte die Auswirkung bestimmter Substanzen auf das Hefewachstum getestet werden, wurden diese zuvor in den angegebenen Konzentrationen zu den noch flüssigen Agarmedien gegeben. Die Platten wurden anschließend zum Schutz vor Austrocknung mit Parafilm^®M (VWR, Radnor, USA), versiegelt und für 3 bis 5 Tage bei 30°C inkubiert. Zur Dokumentation wurden sie dann mit einem Perfection V750 Pro Flachbett-Scanner (Epson, Japan) eingescannt.

2.2.3.2. Calciummessungen in Hefe

Für luminometrische Calciummessungen wurden Hefen des Stammes CEN.SR36-3C (yvc1∆) doppelt transformiert. Im ersten Schritt wurden Hefen mit dem Plasmid pEVP11-AEQ transformiert, welches ein Gen für das Calciumreporterprotein APOAEQUORIN trägt (Batiza et al., 1996), das in der Hefe konstitutiv exprimiert wird.

Erfolgreich transformierte Hefen wurden mittels Leucin-freiem SC-Medium selektiert.

Diese Hefen wurden in einem weiteren Schritt entweder mit dem leeren pYES2-Vektor (Thermo Fisher Scientific (Invitrogen), Waltham, USA) oder pYES2-TaLCT1 (Quelle:

Anna Amtmann) transformiert. Hefen, die sowohl pEVP11-AEQ als auch einen der beiden pYES2-Vektoren trugen, wurden mittels Glucose-haltigen SC-Kulturmedien selektiert, die weder Urazil noch Leucin enthielten. Daraufhin wurden 5 mL SC-Medium (-LEU -URA) mit einer Starterkultur so angeimpft, dass die Kultur bei Wachstum über Nacht (30°C, 150 - 180 UPM), am nächsten Morgen eine Dichte von 1 * 10⁷ Zellen pro mL aufwies. Je nachdem, ob der Einfluss von exogenem Calcium getestet werden sollte oder nicht wurde entweder Calcium-haltiges (0,2 mM CaCl2) oder Calcium-freies SC-Medium verwendet. Zur Rekonstitution des APOAEQUORINs zum aktiven AEQUORIN wurden dem Kulturmedium 1 µM Coelenterazin (Roth, Karlsruhe, Deutschland) hinzugefügt. Als Kohlenstoffquelle diente Galaktose, um die Expression von TaLCT1 über den GAL1-Promoter auf dem pYES2-Plasmid zu induzieren. Von diesen Zellsuspensionen wurden je 200 µL in Luminometerröhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) überführt. Die Messung der Lumineszenz erfolgte in einem Sirius-1 Röhrchenluminometer (Berthold Detection Systems, Pforzheim, Deutschland).

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Für die Analyse der Reaktion auf Salzstress wurde mittels einer Spritze 200 µL SC-Medium mit 2 M Natriumchlorid zur im Luminometer befindlichen Hefesuspension appliziert, was einer Endkonzentration von 1 M entsprach. Um den Effekt von exogenem Calcium zu überprüfen, wurde zu den in Ca²⁺-freiem Medium kultivierten Hefen 200 µL einer Lösung mit 2 M Natriumchlorid, 50 mM MES-KOH pH 7,0 und 25 mM EGTA appliziert. Zur Bestimmung der Gesamtlumineszenz wurde zu den Hefen 400 µL Discharging-Lösung injiziert (2 M Calciumchlorid in 20% Ethanol). Die cytosolischen Calciumkonzentrationen wurden aus den Rohdaten nach dem von Allen et al., 1977 beschriebenen Verfahren berechnet.

2.2.3.3. Messung des cytosolischen pH-Werts in Hefe

Zunächst wurden Hefen, die bereits mit den Vektoren pYES2 bzw. pYES2-TaLCT1 transformiert waren, mit dem Plasmid pJR1138-pHLuorin transformiert. Dieses Konstrukt trägt das Gen für das pH-sensitive GFP-Derivat pHLuorin (Miesenböck et al., 1998; Orij et al., 2009), welches von den Zellen konstitutiv exprimiert wird. Hefen, die beide Plasmide trugen, konnten über Leucin- und Urazil-freie Kulturmedien selektiert werden.

Am Abend vor der Messung wurden 15 mL SC-Medium mit Galaktose in sterilen Erlenmeyerkolben mit einer Starterkultur so angeimpft, dass am nächsten Morgen die Dichte der Kultur 1 * 10⁷ Zellen pro mL betrug. Zur Kalibrierung der pH-Messungen wurden die Hefesuspensionen für 15 Minuten in PBS (+100 µg * mL^-1 Digitonin) inkubiert, zweimal mit PBS (ohne Digitonin) gewaschen und in Citrat/Na2HPO4 Puffern (s.u.) mit verschiedenen pH-Werten (von pH 5,2 bis 7,6) auf eine OD600 von 0,5 resuspendiert. Durch die Behandlung der Zellen mit Digitonin wurden die Zellmembranen porös, wodurch bei der anschließenden Inkubation in den Citrat/Na2HPO4-Puffern das Cytosol der Zellen den gleichen pH-Wert annahm wie der jeweilige Puffer.

Zur pH-Messung wurden je 200 µL Zellsuspension in weiße 96-Loch Mikrotiterpatten (Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich) pipettiert. Die ratiometrische Messung im Mithras LB 940 Mikrotiterplatten-Lesegerät (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) erfolgte bei den Anregungswellenlängen 405 und 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm. Parallel zu den mit pHLuorin-transformierten Hefen wurden auch Hefen gemessen, die kein pHLuorin exprimierten. Dies diente der Bestimmung der Hefe-Eigenfluoreszenz, die von den gemessenen Werten subtrahiert wurde. Anschließend wurden die Werte der gemessenen Emission bei Anregung mit 405 nm durch die gemessene Emission bei Anregung mit 485 nm geteilt. Die so erhaltenen Werte (Ratio405/485) wurden in einem Diagramm gegen die pH-Werte der jeweiligen Puffer aufgetragen (Abb. 2.1). Die Bestimmung der Umkehrfunktion der resultierenden Kalibrierungskurve diente

schließlich in den weiteren Versuchen der Berechnung der cytosolischen pH anhand der gemessenen Fluoreszenzverhältnisse.

Für die eigentlichen pH

abzentrifugiert, das resultierende Zellpellet zwei

gewaschen und in 15 mL des Mediums resuspendiert. Das APLF

Phosphat / Low Fluorescence) entspricht in seiner Zusammensetzung dem normalen AP-Medium (Kapitel 2.1.4), enthält jedoch kein Riboflavin und keine Folsäu

Autofluoreszenz dieser Substanzen die anschließenden Messungen stören würden.

A

Abbildung 2.1. Kalibrierung für Messungen des pH Die Kalibrierung für die Messungen des

exprimierenden Hefen vorgenommen, die in Citrat/Na

wurden. (A) Die aus dem Emissionsverhältnis der Anregung bei 405 nm und 485 nm resultierende Funktion der Kalibrierungskurve wurde mit dem Programm

ermittelte Umkehrfunktion diente in weiteren Versu

gemessenen Fluoreszenzwerten. Gezeigt sind die Mittelwerte (± Standardfehl

Je 200 µL der Zellen wurden in 96 Versuch der Effekt von Natriumchlorid wurden 50 µL einer fünffach konze Hefekulturen injiziert.

Citratlösung

100 mM Zitronensäure

Phosphatlösung

35,62 g * L^-1 Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat

Citrat/Na2HPO4 Puffer (nach McIlvaine, 1921

pH 5,2 46,40 mL Citratlösung + 53,60 mL Phosphatlösung

pH 5,6 42,00 mL

pH 6,0 36,85 mL Citratlösung + 63,15 mL Phosphatlösung 56

schließlich in den weiteren Versuchen der Berechnung der cytosolischen pH Fluoreszenzverhältnisse.

Für die eigentlichen pH-Wertmessungen wurden die Hefesuspensionen abzentrifugiert, das resultierende Zellpellet zwei- bis dreimal mit APLF

gewaschen und in 15 mL des Mediums resuspendiert. Das APLF-Medium (Arginin Low Fluorescence) entspricht in seiner Zusammensetzung dem normalen

), enthält jedoch kein Riboflavin und keine Folsäu Autofluoreszenz dieser Substanzen die anschließenden Messungen stören würden.

B

. Kalibrierung für Messungen des pHcyt in Hefen.

ungen des cytosolischen pH-Werts wurde mit permeabilisierten exprimierenden Hefen vorgenommen, die in Citrat/Na2HPO4-Puffern verschiedener pH

Die aus dem Emissionsverhältnis der Anregung bei 405 nm und 485 nm resultierende on der Kalibrierungskurve wurde mit dem Programm Microsoft EXCEL bestimmt.

ermittelte Umkehrfunktion diente in weiteren Versuchen der Berechnung des pH-Wert gemessenen Fluoreszenzwerten. Gezeigt sind die Mittelwerte (± Standardfehler) von je 4 Messungen.

Je 200 µL der Zellen wurden in 96-Lochplatten pipettiert und gemessen.

triumchlorid auf den cytosolischen pH-Wert getestet werden, wurden 50 µL einer fünffach konzentrierten Lösung in APLF-Medium

itronensäure

Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat

McIlvaine, 1921)

46,40 mL Citratlösung + 53,60 mL Phosphatlösung 42,00 mL Citratlösung + 58,00 mL Phosphatlösung 36,85 mL Citratlösung + 63,15 mL Phosphatlösung

schließlich in den weiteren Versuchen der Berechnung der cytosolischen pH-Werte Wertmessungen wurden die Hefesuspensionen mit APLF-Medium Medium (Arginin-Low Fluorescence) entspricht in seiner Zusammensetzung dem normalen

), enthält jedoch kein Riboflavin und keine Folsäure, da die Autofluoreszenz dieser Substanzen die anschließenden Messungen stören würden.

s wurde mit permeabilisierten pHLuorin-Puffern verschiedener pH-Werte inkubiert Die aus dem Emissionsverhältnis der Anregung bei 405 nm und 485 nm resultierende bestimmt. (B) Die hieraus Werts aus den er) von je 4 Messungen.

atten pipettiert und gemessen. Sollte im Wert getestet werden, Medium zu den

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pH 6,4 30,75 mL Citratlösung + 69,25 mL Phosphatlösung pH 6,8 22,75 mL Citratlösung + 77,25 mL Phosphatlösung pH 7,2 13,05 mL Citratlösung + 86,95 mL Phosphatlösung pH 7,6 6,35 mL Citratlösung + 93,65 mL Phosphatlösung

● pH überprüfen und ggf. nachtitrieren