II. Abkürzungsverzeichnis
3. Material und Methode
3.3 Klonierungen
3.3.4 Klonierung binärer Arabidopsis-Expressionsvektoren
Für die Herstellung binärer Arabidopsis-Expressionsvektoren wurden die Vektoren pCHF_5, pPZP312 sowie pMG2002 verwendet. Die Vektoren sind in Abb. 3.3-4 schematisch dargestellt.
Abb. 3.3-4: Binäre Arabidopsis-Expressionsvektoren.
Während der durch Agrobakterien induzierten Transformation werden die Vektorbereiche zwischen left border und right border in das Arabidopsis-Genom integriert. LB: left border, RB: right border, p35S: CaMV 35S-Promotor, pMas: Mannopinsythase-Promotor, bar: bar-Gen zur Vermittlung der Basta®-Resistenz, uidA: ß-glucuronidase-Gen, Rbcs3´: Pisum sativum Rbcs-Terminator, ocs3´: Octopinsynthase-Terminator nos3´: Nopalinsynthase-Terminator, specR: Spectinomycin-Resistenz, mcs: multiple cloning site. Vektorelemente wurden nicht maßstabsgetreu abgebildet.
pCHF_5 10,5 kb
specR LB
RB p35S
pMas Rbcs 3´
bar ocs 3´
mcs
pPZP312 9 kb
specR LB RB
pMas ocs 3´ bar
mcs
pMG2002 11,3 kb
specR RB LB
p35S nos 3´ bar
mcs nos 3´
uidA
3.3.4.1 Herstellung der Vektoren pAtZR1:ZmET1 und pAtZR1:ZmET1::GFP
Die Plasmide pAtZR1:ZmET1 und pAtZR1:ZmET1::GFP basieren auf dem binären Vektor pPZP312 (Abb. A 3-4). Zunächst wurde der Vektor in der multiple cloning site mit den Restriktionsenzymen SalI und HindIII geschnitten. Der nos-Terminator wurde ebenfalls mit SalI (5´) und HindIII(3´) aus dem TOPO_nos (Tab. 3.3-1) isoliert und in den pPZP312 ligiert.
Anschließend wurde der Vektor mit BamHI und SalI linearisiert. Gleichzeitig wurde der AtZR1-Promotor mit BamHI und SalI aus dem Plasmid pBS_AtZr1-P (3.3.1.1) geschnitten und mit dem pPZP312_nos-Vektor ligiert. Das resultierende Konstrukt pPZP312_AtZR1-P:nos wird in der Folge als pAtZR1:nos bezeichnet (Abb. 3-5) und dient als Basis für die Klonierung der Vektoren pAtZR1:ZmET1 und pAtZR1:ZmET1::GFP.
Zur Herstellung des Konstrukts pAtZR1:ZmET1 wurde der ZmET1-ORF inklusive des Stop-Codons mit NcoI aus dem TOPO_ZmET1ms (Tab. 3.3-1) isoliert. Der Zielvektor pAtZR1:nos wurde über die NcoI-Schnittstelle am 3´-Ende des AtZR1-Promotors (vgl. Abb. 3-5; Primer:
JK47) linearisiert und mit dem ZmET1-ORF fusioniert. Das resultierende Konstrukt pPZP312_AtZR1-P:ZmEt1:nos wird der Folge als pAtZR1:ZmET1 bezeichnet.
Für die Klonierung von pAtZR1:ZmET1::GFP wurde der ORF des GFP inklusive des Stop-Codons mit NcoI und SalI aus dem TOPO_GFP (Tab. 3.3-1) geschnitten und in den NcoI/SalI-geschnittenen pAtZR1:nos ligiert. Das resultierende Konstrukt pAtZR1:GFP:nos wurde anschließend mit NcoI linearisiert. Der ZmET1-ORF wurde exklusive des Stop-Codons mittels PCR amplifiziert (JK54/JK56; template: ET1 GFPII), mit NcoI verdaut und direkt für die Ligation mit dem linearisierten Vektor eingesetzt. Das resultierende Konstrukt pPZP312_AtZR1-P:ZmEt1::GFP:nos wird in der Folge als pAtZR1:ZmET1::GFP bezeichnet.
Abb. 3-5: Schematische Darstellung von pAtZR1:nos, pAtZR1:ZmET1 und pAtZR1:ZmET1::GFP NcoI
nos pAtZR1
SalI HindIII BamHI
NcoI
nos pAtZR1
SalI HindIII
BamHI NcoI
ZmET1
NcoI
nos pAtZR1
SalI HindIII
BamHI NcoI
ZmET1 GFP
pAtZR1:nos
pAtZR1:ZmET1
pAtZR1:ZmET1::GFP
3.3.4.2 Herstellung der Vektoren p35S:ZmET1, p35S:ZmET1::GFP und p35S:ZmET1::DsRed
Die Vektoren p35S:ZmET1, p35S:ZmET1::GFP und p35S:ZmET1::DsRed basieren auf dem Vektor pCHF_5 (Abb. 3.3-4). Zunächst wurde der Vektor in der multiple cloning site mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI geöffnet.
Der ZmET1-ORF wurde inklusive des Stop-Codons mit den Primern JK57/JK58 vom Vektor ET1GFPII amplifiziert, mit den Restriktionsenzymen BglII und SalI geschnitten und in den mit BamHI/SalI linearisierten pCHF_5-Vektor ligiert. Dabei wurde die BamHI-Schnittstelle des Vektors zerstört. Das resultierende Konstrukt pCHF_5_ZmET1 wird in der Folge als p35S:ZmET1 bezeichnet.
Das p35S:ZmET1::GFP-Konstrukt wurde prinzipiell auf die gleiche Weise kloniert, allerdings wurde der vollständige ZmET1::GFP-ORF mit den Primern JK57/JK60 vom ZmET1 GFPII-Vektor amplifiziert.
Für die Herstellung des p35S:ZmET1::DsRed-Vektors wurde der GFP-ORF durch Restriktion mit BamHI und SalI aus dem ZmET1 GFPII-Konstrukt entfernt und durch den DsRed-ORF ersetzt. Dieser wurde zuvor mit den Primern JK61/JK62 vom Plasmid pDsRed2 (Tab. A 2-3) amplifiziert und mit BamHI und SalI restringiert.
Abb. 3.3-6: Schematische Darstellung von pCHF_5, p35S:ZmET1, p35S:ZmET1::GFP, p35S:ZmET1::DsRed.
3.3.4.3 Klonierung von p35S:AtZR2
Der AtZR2-ORF wurde inklusive des Stop-Codons mit den Primern JK66/JK65 vom Plasmid AtZR2GFPII (Tab. A 2-3) amplifiziert, mit BamHI und SalI geschnitten und in den BamHI/SalI-lineraisierten pCHF_5 ligiert.
rbcs3´
p35S
SalI BamHI
pCHF_5
p35S:ZmET1
p35S:ZmET1::GFP p35S
SalI BamHI
ZmET1 rbcs3´
BamHI
p35S
SalI
ZmET1 GFP rbcs3´
BamHI
BamHI
p35S
SalI
ZmET1 DsRed rbcs3´
BamHI
p35S:ZmET1::dsRed
3.3.4.4 Klonierung von p35S:AtZR1strep
Für die Klonierung des Vektors p35S:AtZR1strep wurde zunächst ein Strep-Tag , vergleichbar mit dem Strep-Tag des One-STrEP-Tag-Systems (IBA GmbH, Göttingen), generiert (Abb.
3.3-7), indem vier Primer (JK68, JK69, JK79, JK71) so miteinander ligiert wurden, dass am 5´Ende eine BamHI-Schnittstelle und am 3´Ende eine SalI-Schnittestelle entstand über die das Ligationsprodukt in den mit BamHI/SalI linearisierten pCHF_5 ligiert werden konnte.
Das resultierende Konstrukt pCHF_5_strep wurde anschließend mit BamHI linearisiert und mit der AtZR1 gDNA ligiert. Das Insert wurde zuvor durch einen BamHI-Verdau des Vektors AtZR1 GFPII gewonnen. Das resultierende Konstrukt pCHF_5_AtZR1::strep wird in der Folge p35S:AtZR1strep genannt.
Abb. 3.3-7 Herstellung eines Strep-Tags durch Primer-Ligation.
Zunächst wurden je 5µl der Primer (100µM) JK68 und JK69 bzw. JK70 und JK71 gemischt, 5 Minuten bei 95°C denaturiert und zur Anlagerung 30 Minuten bei RT inkubiert. Die JK68/69- und JK70/71-Primer-Dimere wurden vereinigt und 1 Stunde bei 16°C mit 1U T4-Ligase inkubiert. Das entstandene Ligationsprodukt besitzt am 5´Ende einen BamHI-Überhang und am 3´Ende einen SalI-Überhang zur Ligation in den pCHF_5.
3.3.4.5 Klonierung der Promotor-Reportergen-Konstrukte pAtZR1:gus, pAtZR2:gus, pAtZR3:gus und p4-10:gus
Für die Klonierung des Promotor-Reportergen-Konstrukts pAtZR1:gus wurde der nos-Terminator aus dem Vektor pAtZR1:nos durch Restriktion mit NcoI und HindIII entfernt (vgl.
Abb. 3-5) und durch ein uidA:nos-Fragment ersetzt, das aus dem Verdau des Plasmids pBS_Mu:uidA:nos (Tab. A 2-1) mit NcoI und HindIII stammt. Das resultierende Konstrukt pAtZR1:uidA:nos wird als pAtZR1:gus bezeichnet.
Die Konstrukte pAtZR2:gus, pAtZR3:gus und p4-10:gus basieren auf dem Vektor pMG2002 (Abb. 3.3-4). Das Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und PstI in der multiple cloning site linearisiert. Die Promotor-Fragmente AtZR2-P, AtZr3-P und 4-10-P wurden durch den Verdau der TOPO-Klone TOPO_ AtZR2-P, TOPO_ AtZR3-P und TOPO_ 4-10-P (Tab. 3.3-1) mit den Restriktionsenzymen BglII und PstI gewonnen und jeweils in den linearisierten pMG2002 ligiert. Die resultierenden Konstrukte werden als pAtZR2:gus, pAtZR3:gus und p4-10:gus bezeichnet.
BamHI
SalI JK68
JK69
JK70 JK71