Analyse von HSP70-T-DNA-Insertionsmutanten

Um zu untersuchen, ob der Verlust der Hsp70-Transkripte einen ähnlich starken Einfluss auf die Pflanzenentwicklung hat, wie der Knockout des AtZR1, wurden Arabidopsis T-DNA-Insertionsmutanten für die Gene At4g24280 (Hsp70-1) und At5g49910 (Hsp70-2) untersucht.

Die segregierenden Mutanten-Linien wurden über das Nottingham Arabidopsis stock Centre bezogen.

Homozygote hsp70-1- und hsp70-2-Knockout-Pflanzen wurden mittels genomischer PCR identifiziert. Da die T-DNA-Insertion in den beiden untersuchten SALK-Linien jeweils im zweiten Intron des Gens liegt, ist davon auszugehen, dass die homozygoten Knockout-Pflanzen für das betroffene Gen kein funktionelles Transkript synthetisieren (Abb. 4-61).

Western-Analysen homozygoter hsp70-2-Knockout-Pflanzen zeigten, dass der Verlust des Hsp70-2 keine offensichtlichen Auswirkungen auf die Gesamtmenge an plastidärem HSP70-Protein hat. In der homozygoten hsp70-1-Knockout-Pflanze war hingegen nur noch sehr wenig HSP70-Protein nachweisbar. Ursache für den Nachweis von HSP70-Protein in den beiden Knockout-Linien ist die Expression des jeweils anderen HSP70-Proteins, da der

Antikörper, wie bereits geschildert nicht selektiv zwischen HSP70-1 und HSP70-2 unterscheiden kann. Die unterschiedlichen Restmengen HSP70 in beiden Mutantenlinien korreliert gut mit den unterschiedlichen mRNA-Mengen beider Gene (Abb. 4-60).

Abb. 4-61: Charakterisierung einer Hsp70-1- und einer Hsp70-2-T-DNA-Insertionsmutante A und B) Schematische Darstellung der Gene Hsp70-1 (At4g24280) und Hsp70-2 (At5g49910).

Exons sind als Boxen und Introns als Linien dargestellt. ATG: Translationsstart, *:

Translationsstop. Der Insertionsort der ROK2-T-DNAs in den Salk-Linien 140810 (Hsp70-1) und 095715 (Hsp70-2) ist ebenfalls markiert. Die Pfeile markieren die Primerbindestellen zur Genotypisierung der T-DNA-Insertionsmutanten.

C) Westerndetektion des HSP70-Proteins mit einem HSP70B-spezifischen Antikörper im Chloroplastenprotein einer homozygoten hsp70-2 Knockout-Pflanze sowie von Pflanzen, die in Bezug auf das Hsp70-1 homozygot Wildtyp (+/+), homozygot Knockout (-/-) oder heterozygot (+/-) waren. Als Referenz wurde rekombinantes HSP70-1-his-Protein aufgetragen.

Auch in Bezug auf den Phänotyp ergibt sich ein ähnliches Bild: Während homozygote hsp70-2-Knockout-Pflanzen, in denen die HSP70-Gesamtproteinmenge kaum verändert ist, äußerlich keinen auffälligen Phänotyp entwickeln, wirkt sich der Verlust des Hsp70-1 deutlich auf die Pflanzenentwicklung aus. Die Cotyledonen der Keimlinge sind variegiert und zeigen in den hellen Bereichen keine Autofluoreszenz des Chlorophylls (Abb. 4-62 B). Auch junge atzr1-Keimlinge besitzen vielfach Areale ohne Chlorophyllautofluoreszenz (Abb. 4-62 A). Darüber hinaus sind Blattoberfläche und Blattränder von hsp70-1-Knockout-Pflanzen unregelmäßig geformt. Dieser Phänotyp zeigt sich auch in den ersten Blättern, wird jedoch mit zunehmendem Alter der Pflanzen schwächer. Auch hier bestehen gewisse Parallelen

300bp

ATG

Exon1

HSP70-2

*

2 3 4 5 6 7 8

LB ROK2 RB

+1070

SALK_095715

ATG

Exon1

HSP70-1

*

2 3 4 5 6 7 8

LB ROK2 RB

+1292

SALK_140810

hsp70-1

hsp70-2

+/+ -/- +/- HSP70-1 his

Hsp70-1

α-HSP70B

A

B

C

zwischen dem hsp70-1- und dem atzr1-Phänotyp, bzw. dem Phänotyp teil-komplementierter atzr1/pAtZR1:ZmET1-Pflanzen (Abb. 4-63).

Die hsp70-1-Mutante zeigt außerdem leichte morphologische Veränderungen der Blüte (vergleichbar mit der schwächsten Ausprägung des atzr1-Blütenphänotyps), die mit einer leicht verminderten Fertilität einhergehen. Die Samen der Pflanze entwickeln sich jedoch unauffällig.

Abb. 4-62: Vergleich zwischen der hsp70-1- und der atzr1-Mutante

A und B) Chlorophyll-Autofluoreszenz eines atzr1-Keimlings (A) und eines hsp70-1-Keimlings (B). Pfeile weisen auf Areale ohne Chlorophyll-Autofluoreszenz. C) Ein isolierter atzr1-Embryo wurde mit Hoyer’s Medium geklärt. D) Der geklärte Samen einer Pflanze, die sowohl in Bezug auf das Hsp70-1 als auch das Hsp70-2 heterozygot ist, enthält einen Embryo mit atzr1-ähnlichem Phänotyp.

Trotz einiger Gemeinsamkeiten bestehen wesentliche Unterschiede zwischen der hsp70-1- und der atzr1-Mutante, die in erster Linie die Stärke der phänotypischen Ausprägung betreffen: Im Gegensatz zur atzr1-Mutante ist die hsp70-1-Knockout-Pflanze auf Erde lebensfähig und weist nicht die extremen strukturellen und morphologischen Veränderungen auf, die die atzr1-Mutante zeigt (vgl. Kapitel 4.5.3). Im Vergleich mit einer komplementierenden atzr1/pAtZR1:ZmET1-Linie zeigen sich zwar große Ähnlichkeiten in Bezug auf die veränderte Blattform und -oberfläche, insgesamt erscheint die hsp70-1-Mutante jedoch immer etwas grüner.

Abb. 4-63: Vergleich der hsp70-1- und der Teil-komplementierten atzr1-Mutante A) Col-0-Pflanze 2 Tage, 8 Tage und 21 Tage nach Keimung. B) Teil-komplementierte atzr1/pAtZR1:ZmET1-Pflanze 2, Tage, 8 Tage, 14 Tage und 21 Tage nach Keimung. C) hsp70-1-Mutante 2, Tage, 8 Tage, 14 Tage und 21 Tage nach Keimung.

Um zu untersuchen, inwiefern der vergleichsweise schwache hsp70-1-Phänotyp mit dem zweiten plastidären Hsp70-Gen zusammenhängt, wurden homozygote hsp70-2-Pflanzen auf homozygote hsp70-1-Pflanzen ausgekreuzt. Die heterozygoten +/hsp70-1/+/hsp70-2-Nach-kommen waren durch die Wiederherstellung des Wildtypphänotyps leicht erkennbar. In den unreifen Schoten dieser Pflanzen konnten Samen mit einem deutlichen Mutanten-Phänotyp der Embryonen identifiziert werden. Der beobachtete Phänotyp zeigte signifikante Parallelen zum Phänotyp der atzr1-Mutante (Abb. 4-62 C, D).

In reifen Schoten wurden Samen mit einem segregierendem Phänotyp gefunden werden.

Neben Wildtyp-Samen enthielten die Schoten auch Samen, die unterschiedlich stark kollabiert waren. Nach Aussaat der kollabierten Samen auf Sucrose-haltigem Medium entwickelten sich daraus Pflanzen mit unterschiedlichem Phänotyp. Die Hälfte der Pflanzen zeigte nur leichte morphologische Veränderungen und ein reduziertes Wachstum. Wie die genotypische Analyse dieser Pflanzen zeigte, handelte es sich um homozygote hsp70-2-Knockouts, die in Bezug auf das Hsp70-1 heterozygot waren. Die andere Hälfte der Pflanzen zeigte einen weitaus auffälligeren Phänotyp: Ähnlich wie die atzr1-Mutante, besaßen sie eine erhöhte Anzahl kleiner blasser Rosettenblätter und zeigten einen kompakten Wuchs.

Teilweise ergrünten die Pflanzen nicht richtig und akkumulierten verstärkt Anthocyane. Nach dem Austopfen der Pflanzen auf Erde starben sie jedoch, bevor der Genotyp bestimmt werden konnte. Somit lässt sich nur spekulieren, dass es sich bei diesen Pflanzen eventuell

um homozygote hsp70-1-Mutanten handelte, die heterozygot für das Hsp70-2 oder Doppelknockouts waren.

Zusammenfassend wurde in diesem Kapitel gezeigt, dass die beiden plastidären HSP70-Proteine eine in vitro-Interaktion mit dem AtZR1 eingehen. Eine mögliche Interaktion mit dem AtZR2 ließ sich hingegen nicht untersuchen. Subzelluläre Lokalisationsstudien der HSP-Proteine zeigten, dass sie innerhalb des Chloroplasten unterschiedlich lokalisiert sind.

HSP70-1 liegt, ähnlich wie das ZR1/ETCHED1, im gesamten Stroma vor. Die starke Expression des Gens während der frühen Pflanzenentwicklung bildet ebenso eine Parallele zum ZR1/ETCHED1 wie das Auftreten eines Mutantenphänotyps durch den Knockout des Gens.

Das HSP70-2 co-lokalisiert innerhalb des Chloroplasten sowohl mit ZR2 als auch mit dem PEND-Protein. Auch das Expressionsprofil des Hsp70-2 korreliert im weitesten Sinne mit der Expression des AtZR2. Unter Stress-Bedingungen (z.B. Temperatur, Licht) weichen die Expressionsdaten jedoch voneinander ab.

Obwohl sich HSP70-1 und HSP70-2 in ihrer subzellulären Lokalisation und der entwicklungsabhängigen Expression voneinander unterscheiden, sprechen die Kreuzungs-analysen der T-DNA-Mutanten für eine gewisse funktionelle Komplementation zwischen den beiden Proteinen.