Der Katalyse-Mechanismus und die Struktur von Typ III Zyklasen

Die Strukturen aller Typ III Zyklasen zeigen trotz der Dimerisierungs-Unterschiede (Homo- bzw. Pseudo-Heterodimerisierung) große Ähnlichkeiten 124,130,134,154–157. Typ III Nukleotidyl-Zyklasen gehören zu den α+β Proteinen und weisen eine Ferrodoxin ähnliche Faltung vor.

Beide katalytische Einheiten bestehen jeweils aus einem 7-strängigen β-Faltblatt, das von 3 Helices α2, α3 und α5 nach außen abgeschirmt wird. Die Dimerisierung findet an den Flächen der β-Faltblätter statt und wird durch die β4 - β5 Schleifen, die über die andere Dimer-Einheit ragen, stabilisiert (Abb. 9a).

Die aktiven Zentren werden an der Dimerisierungs-Schnittstelle durch Aminosäuren beider katalytischer Einheiten gebildet (Abb. 9a,b). Hierbei sind sieben konservierte Reste für die NTP Positionierung, die Substratdiskriminierung und für die Katalyse wichtig 130,154,158,159, bei der durch eine intramolekulare nukleophile Substitution (SN2) die Reaktionsprodukte cNMP und PPi entstehen ¹⁶⁰ (Abb. 9c, Sequenz- Vergleich: Anhang Abb. 49). Bei allen Typ III Subklassen koordinieren zwei konservierte Aspartate (D440, D396 in Abb. 9b) die NTP-Phosphatgruppen indirekt über 2 Metallionen (Mn²⁺/Ca²⁺/Mg²⁺). In Analogie zu DNA und RNA Polymerasen ¹⁶¹ und entsprechend ihrer Lokalisation und Funktion unterscheidet man zwischen Metallion A und Metallion B ¹⁶². Ion B bindet das Nukleotid an den β- und γ-Phosphatgruppen (Pβ, Pγ) und wird in der Regel in Liganden-gebundenen Zyklase Strukturen vorgefunden. Dahingegen wird für Ion A eine transiente Bindung zwischen Ribose 3’OH und Pα angenommen, die als essentiell für die Substratpositionierung und die Katalyse angesehen wird ^124,125. Hierbei wird vermutet, dass Ion A das Proton am Ribose 3‘-OH abstrahiert und so 3‘-O für den nukleophilen Angriff aktiviert 116,127,162. Ferner wird davon ausgegangen, dass nach 3‘-O Angriff ein pentavalenter α-Phosphor im Übergangszustand entsteht und dass die resultierende negative Ladung des α-Phosphats durch Ion A und ein konserviertes Arginin (R1029 (α4) in Abb. 9b) stabilisiert wird

130,162. Eine lineare Anordnung zwischen dem angreifenden Ribose-3’Sauerstoffs, des α-Phosphors und der zu spaltenden Pα-O Bindung wird als Voraussetzung für die Katalyse gesehen (Abb. 9c) ^130,162. Neben den beiden Metallionen binden polare Aminosäuren zwischen β1 und α1 das Substrat durch Wasserstoffbrücken zu Pβ und Pγ.

18 Des Weiteren bildet ein Arginin (R484 in Abb. 9b) zu Beginn des β4 Strangs eine Salzbrücke zu Pγ und stabilisiert so die PPi Abgangsgruppe (Ausnahme humanes sAC). Darüber hinaus bildet der katalytisch wichtige Rest N1025 (α4) eine Wasserstoffbrücke zur Ribose (Abb. 9b).

Abb. 9 Struktur und Mechanismus von Typ III Zyklasen am Beispiel von tmAC

(a) Die beiden tmAC Untereinheiten (blau-grün, gelb-rot, PDB: 1CJK) bilden ein antiparallel angeordnetes Pseudo-Heterodimer mit zwei aktiven Zentren am Dimer Interface. Das obere Zentrum ist degeneriert und durch Forskolin besetzt. Das aktivierende Gs-Protein (dunkelgrün) bindet in der Nähe der Forskolin-Bindestelle. (b) Das katalytisch aktive Zentrum (unten in a) bindet das ATP Analogon ATP-αS. Die Bindung der Adeninbase und der Substrat-Phosphatgruppen erfolgt durch Aminosäuren unterschiedlicher Untereinheiten; der Stern (*) markiert das Partnermonomer. Mg²⁺ und Mn²⁺ befinden sich an der Ion A bzw. Ion B Position.

(c) Die intramolekulare Substitutionsreaktion überführt ATP in cAMP und PPi. Im Übergangzustand ist der α-Phosphor 5-fach gebunden und ein negativ geladenes α-Phosphat resultiert. Eine lineare Anordnung zwischen der 3‘-O-Ribose, P-α und der Abgangsgruppe ist Katalyse-voraussetzend. Weitere Einzelheiten bezüglich der Substratbindung und der Katalyse sind im Text dargestellt. tmAC = transmembranständige Adenylylzyklase

Während die Phosphatgruppen des Substrats hauptsächlich von polaren Resten umgeben sind, ist die Nukleotid Base (Adenin oder Guanin) in eine hydrophoben Tasche eingebettet (z.B: Trp, Phe, Val, Ile). Zusätzlich erfolgt die Basenbindung durch 2 polare Aminosäuren, die maßgebend für die Basenselektivität sind ^130,163. Bei Adenylylzyklasen des Typs IIIa werden diese Positionen durch ein Lys/Asp bzw. bei Typ IIIb durch ein Lys/Thr Paar besetzt, die ein selektives Donor/Akzeptor Wasserstoffbrückennetzwerk zum N1-Pyrimidin/6-Aminogruppe des Adenins aufspannen. 1-2 weitere Wasserstoffbrücken (direkt/H20-vermittelt) existieren zwischen der 6-Aminogruppe und dem Proteinrückgrat (u.a. β5) 119,130,162.

19

In Guanylylzyklasen sind diese Positionen durch ein Glu/Cys Paar belegt. Obgleich keine GC Struktur mit gebundenem Ligand existiert, wird in Analogie zu ACs eine Bindung des N1-Pyrmidins und der N2-Aminogruppe zum Wasserstoffbrücken-Akzeptor Glu angenommen.

Darüber hinaus wird eine Wasserstoffbrücke zwischen der C4-Ketogruppe und Cys vermutet

156,164. Gleichermaßen wird bei GCs ein AC-ähnlicher Reaktionsmechanismus für die Bildung von cGMP angenommen ^155,163.

Für die korrekte Substratausrichtung und den Katalyse-Verlauf wird weiterhin eine Annäherung zwischen der α1 Helix und der β7/β8 Schleife als wichtig erachtet, die die Zyklase von einem offenen in einen geschlossenen Zustand überführt ^124,127. Bei CyaC (AC S. platensis) führt diese Bewegung zu einer Positionierung des Übergangszustands-stabilisierenden Arginins nahe Pα

127. Bislang konnte die Ursache und Auswirkung der α1 - β7/β8 Bewegung nicht endgültig geklärt werden. Es bleibt offen, ob der Übergang in den geschlossenen Zustand als Folge der Substratbindung und somit vor der Katalyse stattfindet (tmAC) ¹⁶² oder ob die α1 - β7/β8 Annährung während der Katalyse stattfindet und somit die geschlossenen Strukturen den Protein-Produkt-Komplex darstellen (CyaC) ¹³⁰. Ungeachtet des genauen Reaktionsablaufs herrscht eine konstitutive Aktivität der katalytischen Domäne bei Typ III ACs und GCs vor, die durch die vorausgehenden regulatorischen und integralen Domänen unterdrückt wird

124,127,134,155,165.

Die enzymatische Domäne der RhGCs ist homolog zu Typ III Guanylylzyklasen, jedoch wurde bis zum Beginn dieser Arbeit eine enzymatische Funktion der RhGCs nicht direkt nachgewiesen

1. Somit war unklar, ob RhGCs durch Licht aktiviert werden und als Licht-abhängige Typ III Zyklasen agieren. Neben den RhGCs gibt es ähnlich aufgebaute Photorezeptoren, die sogenannten Photoaktivierten Zyklasen (PACs), bei denen eine Typ III Adenylylzyklase an eine photosensorische BLUF^vii Domäne geknüpft ist. Die BLUF Domäne nutzt FAD^viii als Chromophor ¹⁶⁶. Eine Licht-induzierte cAMP Synthese konnte bei PACs nachgewiesen werden

167–171 und auf die Einzelheiten dieser photoaktivierten Enzyme wird im Folgenden eingegangen.

vii BLUF = sensors of blue-light using FAD

viii FAD = flavin adenine dinucleotide

20