Anwendung des Volllängen BeRhGC in CHO-K1 Zellen

Nach der biochemischen und biophysikalischen Charakterisierung von BeRhGC stellte sich die Frage, ob BeRhGC in Säugetier-Zellen angewendet werden kann, um Licht-abhängig die Synthese von cGMP zu steuern. Um dies zu klären, wurde BeRhGC in eine modifizierte CHO-K1 Zelllinie stabil transfiziert, die den bovinen cGMP-sensitive CNG-A2 Kanal (K1/2(cAMP) = 14 μM, K1/2(cGMP) = 0.7 μM) konstitutiv exprimierte. Vergleichbar mit den elektrophysiologischen Experimenten aus Oocyten öffnet cGMP den CNG Kanal. Der Einstrom von Ca²⁺ Ionen kann durch fluoreszierenden Sensoren (Fura-2 und Fluo-4) nachgewiesen werden ²⁰². Nach Aussaat der transfizierten CHO-K1 Zellen in eine 96-Well Multiplatte und Zugabe des Fluo-4 Sensors wurden einzelne Wells über 50 s mit einer unterschiedlichen Anzahl an 485 nm Lichtblitzen belichtet. Eine Erhöhung der Blitzfrequenz führte zu einer Zunahme der Ca²⁺- abhängigen Fluoreszenz (Abb. 24a), die für Kontrollzellen ausblieb. Weiterhin konnten die Zellen wiederholt stimuliert werden (Abb. 24b). Diese Experimente zeigen, dass BeRhGC als optogenetisches Werkzeug in CHO Zellen angewendet werden.

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Abb. 24 Anwendung von BeRhGC in CHO-K1 Zellen

BeRhGC wurde stabil in eine modifizierte CHO-K1 Zelllinie transfiziert, die den CNG-A2 Kanal (Bos taurus) exprimierte. Eine cGMP-abhängige Öffnung des CNG-A2 Kanals wurde durch fluoreszierende Ca²⁺-Sensoren (Fluo-4, Fura-2) nachgewiesen. (a) Fluo-4 Fluoreszenz-Signal nach Belichtung der BeRhGC-exprimierenden Zellen durch den Multi-Plate-Reader über 50 s mit einer ansteigenden Anzahl an 485 nm Lichtblitzen (1.3 mW mm^-2, schwarz-gestrichelter Balken). Die rote Spur zeigt Kontrollzellen, die kein BeRhGC exprimierten. (b) Fura-2 Fluoreszenz-Signal nach wiederholter Stimulation der BeRhGC-transfizierten CHO-K1 Zellen mithilfe von Weißlicht (schwarze Pfeile, 15 s, 1.3 µW mm^-2). Die dargestellten Werte beruhen auf Triplikat-Messungen und sind repräsentativ für mindestens 2 unabhängige Experimente. RFU = Relative Fluoreszenz Units. Modifizierte Abbildung aus Scheib et al. ¹⁹³, die Daten wurden von Heinz Körschen (Caesar, Bonn) erhoben.

2.3.9 Anwendung von BeRhGC in hippokampalen Rattenneuronen

Nach erfolgreicher Applikation von BeRhGC in CHO-K1 Zellen wurde die Anwendbarkeit von BeRhGC in hippokampalen Neuronen aus der Ratte getestet. Dazu wurden die Neurone mit BeRhGC, dem Fluoreszenzmarker mKate2 und dem cGMP-sensitiven Reporterkanal CNG-A2 transfiziert (Abb. 25a). Die BeRhGC/CNG-A2 exprimierenden Zellen zeigten eine typische Funktionsweise nach Applikation somatischer Ströme (Abb. 25b-c). Vergleichbar zu den vorherigen elektrophysiologischen Experimenten an Oocyten aktivierte grünes Licht BeRhGC und führte zu einer cGMP-vermittelten Öffnung der CNG Kanäle. Die Ioneneinströme wurden mithilfe der Ganzzell Voltage-Clamp Methode detektiert. BeRhGC Zellen ohne den zusätzlichen CNG-A2 Kanal zeigten keine Photoströme (Abb. 25d). Anstatt dessen waren schnelle Einströme beobachtbar, die auf spontane synaptische Transmissionen zurückzuführen wurden. Darüber hinaus konnten BeRhGC/CNG-A2 Zellen über einen Zeitraum von >16 s ohne Signalverlust mehrfach stimuliert werden (Abb. 25e). Eine Verlängerung der Belichtungszeit (10 ms - 10 s) bei sättigender Lichtintensität (19.2 mW mm^-2) korrelierte mit einer Zunahme der Photostrom-Amplitude (Abb. 25f). Eine Analyse der Strommkennkurve nach 100 ms Belichtung erlaubte es, den Signalbeginn nach 99 ms festzustellen (Abb. 25g).

46 Abb. 25 Anwendung von BeRhGC in hippokampalen Rattenneuronen

(a) Fluoreszenz-Aufnahme transfizierter CA1 Neuronen einer hippokampalen Schnittkultur, 10 Tage nach Elektroporation mit BeRhGC und dem Fluorophor mKate2. (b-c) Die Membran-Antwort auf somatische Ströme (-400 - 400 pA) zweier CA1 Neuronen, die mit BeRhGC und dem cGMP-sensitiven Reporterkanal CNG-A2 transfiziert wurden, zeigte die normale Funktionsweise der transfizierten Neuronen. (d) Photoströme von CA1 Neuronen transfiziert mit BeRhGC alleine (schwarz) oder mit BeRhGC und dem cGMP-sensitiven CNG-A2 Kanal (rot), nach 10 s Belichtung mit 530 nm (19.2 mW mm^-2). Die Photoströme wurden bei einer Haltespannung von -65 mV mittels der Ganzzell-Patch-Clamp Technik aufgenommen. Die spontanen synaptischen Einströme waren bei BeRhGC Neuronen nicht geblockt. (e) Wiederholte Stimulation (0.2 Hz) von BeRhGC/CNG-A2 Neuronen durch kurze Lichtpulse (100 ms, 530 nm, 1 mW mm^-2), die Stromkennkurven sind repräsentativ für 3 Neurone. (f) Repräsentative Photoströme von BeRhGC/CNG-A2 Neuronen (n = 7), die unterschiedlich lang belichtet wurden (10 ms - 10 s, 530 nm, 19.2 mW mm^-2). (g) Vergrößerung der *Region aus (f) verdeutlicht die Anfangsphase der Photoströme nach 100 ms, 300 ms, und 1 s Belichtung.

Modifizierte Abbildung aus Scheib et al ¹⁹³, basierend auf den Daten von Christine Gee (UKE Hamburg).

Zusammenfassend für diesen Abschnitt belegen alle bisherigen Experimente die Funktionsweise von BeRhGC, die als Rhodopsin-aktivierte Guanylylzyklase agiert und nach Grünbelichtung spezifisch cGMP bildet. Ferner konnte die Anwendbarkeit von BeRhGC als optogenetisches Werkzeug zur Kontrolle von cGMP-abhängigen Signalwegen in verschiedenen Säugetierzellen gezeigt werden. Der Großteil der hier dargestellten Daten wurde 2015 veröffentlicht ¹⁹³. Parallel erschienen Publikationen ^26,27,194 bestätigten die geringe Dunkelaktivität, Substrat-Spezifität, sowie die optogenetische Anwendbarkeit von BeRhGC.

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2.4 CaRhGC Charakterisierung

Basierend auf der elektrophysiologischen Anfangscharakterisierung (Abb. 11) konnte neben BeRhGC die Rhodopsin-Guanylylzyklase von Catenaria anguillulae, CaRhGC, als interessanter Kandidat für optogenetische Anwendungen identifiziert werden. Im Folgenden wurde CaRhGC einer detaillierten biochemischen und biophysikalischen Analyse unterzogen.

Der Aufbau von CaRhGC entspricht dem von BeRhGC und umfasst eine N‘-terminale Extension mit 2 vorhergesagten Helices (Helix -1,0), eine mikrobielle Rhodopsin Sequenz, einen Coiled-Coil Linker und eine Typ III Guanylylzyklase. Die Sequenzähnlichkeit zu BeRhGC ist hoch und beträgt 77 % (Abb. 26). Bei beiden RhGCs sind die ersten 68 Aminosäuren des N’-Terminus beinahe identisch. Weiterhin liegt eine hohe Sequenzidentität in der Coiled-Coil & Guanylylzyklase Domäne vor (93 % Sequenzidentität, 442-626 AS). Die größten Sequenz-Unterschiede befinden sich in der N‘-terminalen Extension zwischen den Aminosäuren 72 - 170. Obgleich viele Serine zwischen AS 104 - 122 bei CaRhGC vorkommen, liegen die auffälligen Ser-Gly Wiederholungen von BeRhGC bei CaRhGC nicht vor. Darüber hinaus zeigt eine Analyse des CaRhGC N’-Terminus (Anhang Tabelle 13) eine hohe Coiled-Coil Wahrscheinlichkeit für Helix -1, die bei BeRhGC nicht vorliegt (Anhang Tabelle 14).

48 Abb. 26 Vergleich der Aminosäuren-Sequenzen von BeRhGC und CaRhGC

Der paarweise Vergleich beruht auf den Sequenzen von RhGC aus Catenaria anguillulae (CaRhGC, gb: MF939579) und RhGC aus Blastocladiella emersonii (BeRhGC, gb:

AIC07007.1) und wurde mithilfe von Emboss Needle 6.6.0 (Gap Penalty 15) erstellt. Identische Aminosäuren sind dunkelblau schattiert, Unterschiede sind hellblau unterlegt. Beide RhGCs bestehen aus drei aufeinanderfolgenden Domänen, der Rhodopsin, der Coiled-Coil und der Guanylylzyklase Domäne (Domänenbeginn laut Avelar et al ¹). Die CaRhGC Sekundärstrukturelemente sind unterhalb des Vergleichs gezeigt (Helices in magenta, β-Stränge in grün), die Vorhersage der Sekundarstrukturen (AS 1-442) beruht auf JPred4 ²⁰³ gemäß Scheib et al ¹⁹³. Die Sekundärstrukturelemente innerhalb der Guanylylzyklase beruhen auf der CaAC Kristallstruktur.

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