Isolierung von DNA

3.2.1.3.1 Mini-Präparation von Plasmid-DNA (Qiagen-Methode) (Qiagen-Handbook, April 1997)

Die Plasmidpräparationen wurden nach Vorschrift des Herstellers und unter Verwendung der mitgelieferten Puffer durchgeführt. 5 ml LB-Medium mit 200 µg/ml Ampicillin wurden mit einer transformierten E. coli-Kolonie angeimpft und über Nacht bei 37 °C auf dem Drehrad inkubiert. 2 ml der Bakteriensuspension wurden 5 Minuten in der Eppendorff-Zentrifuge bei 1.800 xg (6.000 rpm) zentrifugiert. Das Zellsediment wurde in 250 µl eiskaltem Puffer P1 aufgenommen, mit 250 µl Puffer P2 versetzt und 50 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend wurden 350 µl Puffer P3 zugegeben und die Lösung 15 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt von 10 Minuten bei 12.000 rpm wurde der Überstand auf eine Minisäule gegeben und diese 1 Minute bei 12.000 rpm zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen, 750 µl Puffer PE auf die Säule gegeben und diese erneut 1 Minute zentrifugiert. Dieser Durchfluß wurde ebenfalls verworfen und die Säule 1 Minute trockenzentrifugiert. Die Elution der gebundenen DNA erfolgte mit 100 µl H₂O bidest.

3.2.1.3.2 Midi-Präparation von Plasmid-DNA (Qiagen-Methode) (Qiagen-Handbook, April 1997)

Die Plasmidpräparationen wurden nach Vorschrift des Herstellers Qiagen und unter Verwendung der mitgelieferten Puffer durchgeführt.

P1: 50 mM Tris/HCl pH 8,0

10 mM EDTA

100 µg/ml RNase A

P2: 0,2 M NaOH

1 % SDS

P3: 3 M Kaliumacetat (KAC) pH 5,5

QBT: 750 mM NaCl

50 mM MOPS pH 7,0 15 % Ethanol 0,15 % Triton X-100

QC: 1 M NaCl

50 mM MOPS pH 7,0 15 % Ethanol

QF: 1,25 M NaCl

50 mM Tris/HCl pH 8,5 15 % Ethanol

Ausgangsmaterial für diese Präparation waren 120 ml einer Bakterienkultur mit einer OD₆₀₀ von größer als 1,0. Diese wurde bei 8.500 xg im JA-10-Rotor (8.000 rpm) sedimentiert. Das Bakterienpellet wurde in 4 ml Puffer P1 resuspendiert, in JA-20 Röhrchen überführt, mit 4 ml Puffer P2 versetzt, vorsichtig durch Invertieren gemischt und 5 Minuten bei RT inkubiert. Durch Zugabe von 4 ml eiskaltem Puffer P3 und sofortigem Invertieren wurde neutralisiert und anschließend 10-15 Minuten auf Eis inkubiert. Danach wurde der Ansatz 30 Minuten bei 30000 x g (18.000 rpm) im JA-20-Rotor zentrifugiert (4 °C), der Überstand durch zwei Lagen Mull auf eine mit 4 ml QBT-Puffer äquilibrierte Qiagen-Plasmid Prep Tip100-Säule gegeben. Die Plasmid-DNA bindet an das Silikagel-Anionenaustauscher-Säulenmaterial. Die Säule wurde zweimal mit 10 ml QC-Puffer gewaschen, die Plasmid-DNA anschließend mit 50 ml QF-Puffer eluiert und in einem 50 ml Röhrchen aufgefan-gen. Die DNA wurde mit 0,7 Volumen Isopropanol (100 %) gefällt und bei 4 °C und 4.400 xg für mindestens 45 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 70 % Ethanol gewaschen, bei RT oder im Vakuumtrockner getrocknet und in einem geeignetem Volumen H₂O bidest. aufgenommen. Die DNA-Konzentration wurde durch eine Messung der OD₂₆₀ bestimmt.

3.2.1.3.3 Auftrennung von DNA in Agarosegelen

Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe wurden Agarosegele verwendet. Die für die Gele benutzte Konzentration an Agarose richtete sich nach der Größe der zu trennenden DNA-Fragmente:

Agarose-Konzentration [%] Trennbereich [kb]

0,6 20-1

0,9 7-0,5

1.2 6-0,4

1,5 4-0,2

2,0 3-0,1

Proben-Puffer (LP IV): 0,25 % (w/v) Bromphenolblau 40 % (w/v) Saccharose in 1 x TAE

Ficoll-Marker: 0,05 % (w/v) Bromphenolblau

0,05 % (w/v) Xylencyanol 15 % (w/v) Ficoll

Die erforderliche Menge an Agarose wurde in 300 ml 1x TAE aufgekocht (Mikrowelle) und nach Abkühlen auf 55 °C mit Ethidiumbromid versetzt (Endkonzentration 0,5 µg/ml).

Die Agarose wurde in eine Gelform gegossen und bei RT abgekühlt. Das erstarrte Gel wurde in die Elektrophoresekammer überführt, die Proben mit 10-20 % Ficoll-Marker versetzt und in die vorgeformten Geltaschen pipettiert. Die Elektrophorese wurde mit einer Spannung von 3-4 V/cm durchgeführt. Durch das in die DNA interkalierende Ethidiumbromid werden die DNA-Fragmente unter UV-Licht als Banden sichtbar und das Gel konnte auf dem UV-Transilluminator analysiert werden. Zur Dokumentation wurde das Agarosegel auf dem UV-Transilluminator mit einem Videosystem aufgenommen und ein Ausdruck des Bildes erstellt.

3.2.1.3.4 Ligation

Ligationsmix: x µl Vektor-DNA nach Restriktionsspaltung (10-20 ng) y µl DNA-Fragment (10 facher molarer Überschuß) 1 µl 10x T4-DNA-Ligasepuffer

Endkonzentration: 50 mM Tris/HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl; 10 mM DTT; 1 mM ATP; 25 µg/ml BSA

1 µl T4-DNA-Ligase80 NEB-Einheiten/µl ad 10 µl HO bidest.

Die Ligation erfolgte über Nacht bei 16 °C oder 2 Stunden bei Raumtemperatur.

3.2.1.3.5 DNA-Amplifizierung über die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) (SAIKI et al. 1986 und SAIKI et al. 1988)

Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ist eine Methode um definierte DNA-Fragmente zu amplifizieren. Die Grundlage für diese Technik bildet die Entdeckung und Isolierung einer thermostabilen DNA-Polymerase (Taq) des thermophilen Bakteriums Thermophilus aquaticus von SAIKI et al. (1888).

Der der PCR zugrunde liegende Mechanismus beinhaltet drei Schritte, die für jede DNA-Amplifizierung nötig sind:

1. Denaturierung der Ausgangs DNA (Template) in Einzelstränge

2. Annealing: Die Bindung von Oligonukleotidprimern an beide Einzelstränge.

3. Extension: Die Synthese der DNA, ausgehend von den gebundenen Primern.

Als Template wurde DNA verwendet, die mit der Plasmidpräparation nach Quiagen präpariert wurde. Die Taq-Polymerase wurde zusammen mit dem 10x konzentrierten Puffersystem und dem Ultrapure dNTP-Set von der Firma Pharmacia bezogen. Das dNTP-Set wurde von 100 µ je Nukleotid auf 12,2 µM verdünnt (dNTP-Mix).

PCR-dNTP-Mix: 12,5 mM je Nucleotid (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 10x PCR-Puffer: 800 mM Tris/HCl pH 8,9

200 mM (NH₄)SO₄

50 mM MgCl

Taq-DNA-Polymerase: 2,5 U/ml

Bei jeder PCR wurden zwei Kontrollen mitgeführt, um die verwendeten Lösungen auf Kontaminationen zu testen. Es wurde jeweils eine Probe ohne Template und eine Probe ohne Primer angesetzt. In beiden Kontrollen kann nur im Fall einer Kontamination ein PCR-Produkt entstehen.

PCR-dNTP-Mix: je 25 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP

10x PCR-Puffer: 500 mM KCl

15 mM MgCl2

100 mM Tris/HCl pH 9,0 Taq-DNA-Polymerase: 5 U/µl

Reaktionsansatz: 10 µl 10x PCR-Puffer 2 µl PCR-dNTP-Mix 40 pmol Primer 1

40 pmol Primer 2

1 µg DNA

1 µl Polymerase

ad 100 µl H₂O, bidest.

PCR-Programm: Das PCR-Programm ist abhängig von der DNA-Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (Beispiel siehe Abschnitt 3.2.1.4).

Zur Analyse wurden von jedem PCR-Ansatz je 20 µl entnommen, mit Auftragspuffer gemischt und auf einem 1 % Agarosegel aufgetrennt.