Die Ergebnisse der vorangegangenen Versuche hatten gezeigt, daß der LAP-Tail die Recyclingfähigkeit des Proteines vermittelt. Im weiteren Verlauf der Arbeit sollte eine genauere Eingrenzung der für das Recycling notwendigen Tail-Sequenzbereiche vorge-nommen werden. Da der 19 Aminosäuren lange LAP-Tail im Aufbau und der Art seines Tyrosinsignales starke Ähnlichkeit mit dem Lamp1-Tail besitzt, wurden in den folgenden Experimenten die beiden Tailsequenzen genauer analysiert.
4.2.1 Neuraminidase-Assay der LAP-D7-Mutante
Der auffälligste Unterschied zwischen den zytoplasmatischen Domänen von LAP und Lamp1 besteht in der distalen LAP-Tail-Sequenz von 7 Aminosäuren (Abbildung 4.19, AA 13-19), die dem Tyrosinsignal folgt. Diese Sequenz ist im Lamp1-Tail nicht vorhanden, der direkt hinter dem Tyrosinmotiv endet. Da die bisherigen Versuchsergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß der Lamp1-Tail im Gegensatz zum LAP-Tail kein Recycling vermitteln kann, sollte untersucht werden, ob diese distale LAP-Sequenz für das Recycling verantwortlich ist. Deshalb wurde eine LAP-Mutante getestet, der die letzten 7 Aminosäuren des Tails fehlen, so daß der Tail direkt hinter dem Tyrosinmotiv endet (LAP D7, Abbildung 4.19).
Wie das IEF-Gel in der Abbildung 4.16 zeigt, verhält sich LAP D7 im Neuramini-dase-Assay wie Wildtyp LAP. Ohne Neuraminidasebehandlung lagen 3 % von LAP D7 in der basischen Fraktion vor (Abbildung 4.16, Probe 2). Dieser Anteil erhöhte sich auf 19 % wenn die Zellen bei 4 °C mit Neuraminidase inkubiert wurden (Abbildung 4.16, Probe 1).
Es befanden sich also mindestens 16 % der Mutanten an der Plasmamembran. Nach Inkubation der Mutante mit Neuraminidase bei 37 °C stieg der Anteil basischer LAP-Formen innerhalb von 20 min auf 88 %.
Abbildung 4.16: Neuraminidase-Assay mit BHK 21-LAP D7-Zellen. Der Neuramini-dase-Assay erfolgt wie unter Abbildung 4.2 beschrieben. Die immunpräzipitierte, membranintegrierte LAP wurde in einer IEF sowie einer SDS-PAGE aufgetrennt (Auf-arbeitung siehe Abbildung 4.2). Die Pfeile am linken Rand zeigen die Position verschie-dener isoelektrischer Punkte. Die prozentualen Angaben entsprechen dem Anteil der basischen LAP D7-Fraktion (pH 5,8-6,2) in Relation zum Gesamtsignal aller fokussierter LAP D7-Formen
In der Abbildung 4.17 ist die Kinetik für den Austausch von endosomaler LAP mit der Plasmamembran dargestellt. Wie die Auswertung der IEF-Daten in der Grafik 4.16 zeigt, stimmt die Kinetik für LAP-WT und LAP-D7 überein. Folglich sind die ersten 12 Aminosäuren des LAP-Tails für die Vermittlung eines schnellen Austausches von intrazellulärer, neusynthetisierter LAP mit der Plasmamembran ausreichend. Der komplette distale Tail-Abschnitt (AA 13-19) hat keinen Einfluß auf diese Funktion.
Abbildung 4.17: Gegenüberstellung der Neuraminidase-Kinetik von LAP-WT- und LAP D7. Der Neuraminidase-Assay wie unter Abbildung 4.2 beschrieben durchgeführt.
Auf der X-Achse sind die Neuraminidaseinkubationszeiten bei 37 °C angegeben [min]. Die intrazelluläre, membranintegrierte LAP-Fraktion, die während dieser Inkubation die Plasmamembran erreichte, wird auf der Y-Achse angezeigt. Dieser Wert wird in Relation zur gesamten fokussierten LAP angegeben.
4.2.2 Recycling-Assay der LAP D7-Mutante
Der Recycling-Assay wurde wie in Abschnitt 4.1.3 beschrieben mit LAP D7 expri-mierenden Zellen durchgeführt. Die Abbildung 4.18 zeigt die auf dem Nitrozelluloseblot detektierte biotinylierte LAP-Fraktion in den Proben 1b, 2b und 3b. Während der 2. Rekultivierung konnten 45 % der internalisierten, biotinylierten LAP D7 aus den Endosomen zur Plasmamembran rezyklisieren. Da der rezyklisierte LAP-WT-Anteil unter identischen Bedingungen einen Wert von 47 % ergibt, rezyklisiert LAP D7 mit der selben Effizienz wie LAP-WT. Folglich wird der distale Bereich des LAP-Tails (AA 13-19) nicht für die Vermittlung des Recyclingprozesses benötigt.
Abbildung 4.18: Recycling von LAP-WT, LAP D7- und LAP-Lamp1/LAP-Zellen. Die Durchführung des Recycling-Assays sowie die Probenaufarbeitung und Quantifizierung der Proben erfolgte wie unter der Abbildung 4.6 beschrieben. Der angegebene prozentuale Wert gibt die Größe der rezyklisierten Fraktion in Relation zur internalisierten, LAP-Fraktion wieder.
4.2.3 Recycling-Assay von LAP-Lamp1/LAP 4.2.3.1 Die Tail-Chimäre (LAP-Lamp1/LAP)
Die Ergebnisse der Experimente mit der LAP D7-Mutante ergaben, daß der komplette distale Bereich des LAP-Tails (AA 13-19) keinen Einfluß auf das Recycling hat. Um eine weitere Eingrenzung der Recycling-vermittelnden LAP-Tail-Sequenz vornehmen zu können, erfolgte eine Untersuchung des proximalen Tail-Bereiches hinsichtlich seines Einflusses auf das Recycling. Der kurze proximale Abschnitt vor dem Tyrosinmotiv umfaßt im LAP-Tail 8 Aminosäuren und im Lamp1-Tail 7 Aminosäuren. Damit der Einfluß des proximalen LAP-Tail-Abschnitts getrennt vom Einfluß des LAP-Tyrosin-motivs untersucht werden konnte, wurde die Tail-Chimäre (Abbildung 4.19) konstruiert.
Durch PCR-Mutagenese wurde der proximale Lamp1-Tail-Abschnitt (AA 1-7) mit dem LAP-Tyrosinmotivs (AA 9-12) fusioniert. Dieser fusionierte, 11 Aminosäuren lange Tail, ist über die LAP-Transmembrandomäne mit dem luminalen LAP-Bereich verknüpft. Nach
dem Einklonieren des Konstruktes in den pBEH-Vektor wurden BHK 21-Zellen stabil mit dem Plasmid transfiziert. Die Selektion erfolgte gegen Puromycin. Der für den Recycling-Assay ausgewählte Klon hatte einen LAP-Expressionslevel von 0,8 (relativ zur LAP-WT Expressionshöhe in BHK 21-Zellen, Bestimmung des Expressionslevels siehe Abschnitt 4.1.1).
Abbildung 4.19: Aminosäuresequenz der Zytoplasmatischen Domäne von LAP-WT, Lamp1-WT, LAP D7 und LAP-Lamp1/LAP (Tail-Chimäre).
4.2.3.2 Recycling der Tail-Chimäre
Der Recycling-Assay wurde wie in 4.1.3 beschrieben mit der Tail-Chimäre durchgeführt.
Die Abbildung 4.18 zeigt die auf dem Nitrozelluloseblot detektierte biotinylierte LAP-Fraktion der Proben 1b, 2b, 3b. Im Verlauf der 1. Rekultivierung wurde biotinylierte, plasmamembranständige Tail-Chimäre in die Zelle aufgenommen (Probe 2b) und konnte somit vor der anschließenden Glutathion/DTT-Behandlung geschützt werden. Während der 2. Rekultivierung rezyklisierten 42 % dieser geschützten Fraktion aus den Endosomen zur Plasmamembran. Da der rezyklisierte LAP-WT-Anteil im Recycling-Assay einen Wert von 47 % erreicht, rezyklisiert die Tail-Chimäre mit der selben Effizienz wie LAP-WT.
Damit konnte gezeigt werden, daß der komplette proximale Bereich des LAP-Tails (AA 1-8) für die Vermittlung des Recyclingprozesses nicht benötigt wird. Die LAP rezyklisierte obwohl der proximale LAP-Bereich durch den proximalen Lamp1-Bereich ersetzt wurde. Dieses Ergebnis zeigt, daß das LAP-Tyrosinmotiv für die Vermittlung des Recyclingprozesses ausreichend ist.
4.3 In vitro Untersuchungen zur Interaktion zwischen AP 1 und