Isolation und Transduktion primärer Hepatozyten

56 MOI 10

50 µm 50 µm 50 µm

MOI 40 MOI 80

Abbildung 14: RGB-Markierung primärer muriner Hepatozyten mit unterschiedlichen Transduktionsraten. Dargestellt sind Fluoreszenzaufnahmen der Zellkultur als Overlay. Primäre murine Hepatozyten wurden gleichzeitig mit den RGB-Vektoren mit unterschiedlichen MOIs transduziert. Bei einer MOI von 10 je RGB-Vektor wurden die Zellen zum großen Teil nur mit den Farben rot, grün und blau markiert, während bei einer MOI von 80 je RGB-Vektor eher weiß-graue Farben entstanden sind. Eine große Anzahl verschiedener Farben findet sich bei einer MOI von 40 je RGB-Vektor.

4.5. Klonale Zusammensetzung der Leberregeneration durch

57 deutlich reduziert werden. Daher wurden die primären Hepatozyten unter der Verwendung eines im Labor entwickelten Protokolls transduziert, das eine effiziente Transduktion primärer Hepatozyten innerhalb von nur einer Stunde ermöglicht (siehe Kapitel 3.4.5.). Bei der Verwendung dieses Protokolls musste auf Grund der kurzen Transduktionsdauer die Menge des vektorhaltigen Überstandes von einer MOI von 40 auf eine MOI von 80 je RGB-Vektor verdoppelt werden, um eine Transduktionsrate von etwa 60% je RGB-Vektor zu erreichen.

Eine weitere Problematik kam hinzu. Die Transduktionsraten konnten vor der Transplantation nicht ermittelt werden, da für deren Bestimmung die Expression der Fluoreszenzproteine nötig war. Die Fluoreszenzen waren aber erst nach drei Tagen messbar und erreichten ihre volle Intensität nach fünf Tagen. Die Zellen mussten jedoch unmittelbar nach der Isolation und Transduktion transplantiert werden. Die Transplantation der RGB-markierten Zellen erfolgte also ohne genau zu wissen, ob eine effiziente Transduktionsrate für die RGB-Markierung erreicht worden war. Für die spätere Analyse wurde daher ein Teil der transduzierten Zellen für vier Tage in vitro kultiviert. Auf diese Weise konnte kontrolliert werden, ob die Transduktion effizient genug war, um die Hepatozyten mit vielen verschiedenen Mischfarben zu markieren (Abbildung 15).

Isolation primärer Hepatozyten

C57Bl/6J

uPA/SCID

Transplantation

Hepatozyten

Zellkulturkontrolle

Hepatozyten

1-stündige Transduktion

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Abbildung 15: Isolation, Transduktion und Transplantation primärer Hepatozyten. Zunächst wurden primäre Hepatozyten aus einer C57Bl/6J-Maus durch eine 2-Schritt-Kollagenase-Perfusion isoliert. Die isolierten primären Hepatozyten wurden in Suspensionsplatten überführt und dort für die Dauer von einer Stunde mit den RGB-Vektoren transduziert. Unmittelbar danach wurden die Zellen durch intrasplenale Injektion in uPA/SCID-Mäuse transplantiert. Da die Transduktionsrate nach der einstündigen Transduktion nicht ermittelt werden konnte, wurde ein Teil der transduzierten Zelle als in vitro-Kontrolle kultiviert. Die Transduktionsrate konnte auf diese Weise vier Tage nach der Transduktion und Transplantation durch eine durchflusszytometrische Messung bestimmt werden.

58 4.5.2. Transplantation und Regeneration: RGB-markierte primäre murine

Hepatozyten in heterozygoten uPA/SCID-Mäusen

Fünf heterozygoten uPA/SCID-Mäusen wurden jeweils 1 Millionen RGB-markierte primäre murine Hepatozyten transplantiert. Die Transplantation der Zellen erfolgte, wie im Kapitel 3.5.3. beschrieben, durch eine intrasplenale Injektion der Zellen. Ein Teil der Zellen wurde - wie oben beschrieben - als Kontrolle für die Transduktionseffizienz in vitro kultiviert. Die Analyse der Zellkulturkontrolle vier Tage nach der Transduktion ergab, dass die primären murinen Hepatozyten bei der einstündigen Transduktion mit einer MOI von 80 je RGB-Vektor mit vielen verschiedenen Fluoreszenzfarben markiert worden sind (Abbildung 16A). Ein geringer Anteil der Hepatozyten war jedoch nicht transduziert worden und besaß daher keine Fluoreszenzfarbmarkierung. Auch diese nicht-markierten Hepatozyten dürften entsprechend ihrem Anteil zur Repopulation der Mäuselebern beigetragen haben.

Vier Wochen nach der Transplantation wurden die Mäuse sakrifiziert, die Lebern aus dem Situs der Mäuse herauspräpariert und fixiert (siehe Kapitel 3.6.). Am Kryotom wurden 7 µm dicke Schnitte der gefrorenen Leberlappen angefertigt und am Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Durch die Fluoreszenz konnten die transplantierten Zellen in der Leber identifiziert werden. Zudem konnte durch die Technik der RGB-Markierung die klonale Zusammensetzung der Leberregeneration beurteilt werden. In der Leber konnten viele Zellen mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarben identifiziert werden, woraus geschlossen werden kann, dass die Leber durch mehrere transplantierte Zellen repopuliert bzw. regeneriert worden ist. Mit Hilfe der RGB-Markierung konnte zusätzlich gezeigt werden, dass sich die Zellen nach dem Engraftment und der Integration mehrmals in der Leber geteilt haben (Abbildung 16B). Dabei war innerhalb der meisten Repopulationsareale nur eine spezifische Fluoreszenzfarbe sichtbar. Diese Areale sind folglich durch Expansion einer einzelnen angewachsenen Zelle entstanden. Gleichzeitig gab es auch Repopulationsareale, innerhalb derer zwei bis vier unterschiedliche Fluoreszenzfarben sichtbar waren. Diese Areale wurden von mehreren angewachsenen Zellen gebildet (Abbildung 16C).

59

C

Venus Cherry

Cerulean

*

Overlay

100 µm

B

250 µm 100 µm 100 µm

A

50 µm

Abbildung 16: Regeneration der geschädigten Leber einer heterozygoten uPA/SCID-Maus durch RGB-markierte primäre Hepatozyten. (A) Ein Teil der transduzierten Zellen wurde für die Bestimmung der Transduktionsrate als in vitro-Kontrolle kultiviert. Dargestellt sind Fluoreszenzaufnahmen der Zellkultur als Overlay. An den Einzelzellaufnahmen wird deutlich, dass bei der einstündigen Transduktion mit einer MOI von 80 je RGB-Vektor die Hepatozyten mit vielen verschiedenen Fluoreszenzfarben markiert werden konnten. Somit wurden ausreichend hohe Transduktionsraten für eine effiziente RGB-Markierung erreicht. (B) Dargestellt sind Fluoreszenz-Overlays der Leberschnitte von uPA-Mäusen vier Wochen nach der Transplantation RGB-markierter primärer Hepatozyten. Durch die RGB-Markierung wird sichtbar, dass viele Zellen bzw. Zellklone in der Leber angewachsen sind und durch Proliferation unterschiedlich große Repopulationsareale gebildet haben. (C) Beispiel eines Repopulationsareals mit den Fluoreszenzaufnahmen der einzelnen Fluoreszenzfilter und deren Übereinanderlagerung als Overlay. An diesem Beispiel wird deutlich, dass bei der Verwendung einer einzigen Fluoreszenzfarbe als Marker die Zahl der Klone eines Regenerationsareals unterschätzt werden kann. Bei der Betrachtung einer Fluoreszenzfarbe - zum Beispiel Cerulean - könnte man annehmen, dass das Repopulationsareal von einer, vielleicht auch von zwei engrafteten Zellen gebildet worden ist (*). Bei der Betrachtung der roten und der grünen Fluoreszenz wird deutlich, dass das Areal aus 3 Klonen besteht. Ein oberer Klon exprimiert Cerulean und Venus, was im Overlay eine türkise Fluoreszenzfarbe ergibt. Der mittlere Klon exprimiert nur Cerulean, während der untere Klon alle drei Fluoreszenzproteine exprimiert und damit im Overlay eine weiße Fluoreszenz besitzt (Weber et al. 2011).

60 Die RGB-markierten Zellen in der Leber wurden zusätzlich durch eine immunhistochemische Färbung identifiziert (Abbildung 17). Hierbei wurden serielle 7 µm Leberschnitte angefertigt, von denen ein Leberschnitt am Fluoreszenzmikroskop betrachtet und der jeweils darauf folgende Leberschnitt immunhistochemisch gefärbt wurde. Für die Färbung wurde ein GFP-Antikörper verwendet, der sowohl Cerulean als auch Venus als Antigen erkennt und bindet.

mCherry konnte vom Antikörper jedoch nicht gebunden werden (siehe Kapitel 3.6.4.). Daher konnten Zellen, die ausschließlich mCherry exprimierten, nicht angefärbt werden. Die Sichtbarmachung der gebundenen Antikörper erfolgte durch eine Peroxidasereaktion. Des Weiteren wurden die Zellkerne mit Hämatoxillin angefärbt. Durch die immunhistochemische Färbung konnten die RGB-markierten Hepatozyten histologisch analysiert werden (Abbildung 17): Die transplantierten RGB-markierten Zellen haben sich in das Lebergewebe des Wirtes integriert und durch Proliferation morphologisch gesundes Lebergewebe gebildet.

Mit Hilfe des Protokolls für eine kurzzeitige, einstündige Transduktion konnte sowohl die Vitalität der Zellen als auch das Potential, in die Leber zu integrieren und dabei gesundes Lebergewebe zu bilden, erhalten werden. In dem histologischen Bild ist zudem sichtbar, dass auch die wirtseigenen Hepatozyten die Leber regeneriert haben. In heterozygoten Mäusen kommt es häufig zu dem Effekt, dass einige Hepatozyten das uPA-Transgen durch somatische Rekombination verlieren und auf diese Weise gesundes Lebergewebe bilden können (Sandgren et al. 1991). Daher war auch außerhalb der Repopulationsareale gesundes Lebergewebe vorhanden. Einige der gesunden Areale könnten potentiell auch von nicht-transduzierten Hepatozyten gebildet worden sein (s.o.).Durch die Anfertigung serieller Schnitte konnten beide Methoden - die RGB-Markierung und die Immunhistochemie - parallel betrachtet werden. Mit beiden Methoden konnten die transplantierten Zellen eindeutig in der Leber identifiziert werden. Bei Anwendung der RGB-Markierung konnte zusätzlich die klonale Zusammensetzung der Zellen analysiert werden, was mit der immunhistochemischen Färbung nicht möglich war.

61

100 µm

Abbildung 17: Immunhistochemische Färbung der Repopulationsareale. Zwei serielle 7 µm Leberschnitte eines Leberlappens wurden angefertigt. Einer der beiden Leberschnitte wurde am Fluoreszenzmikroskop betrachtet und ist als Overlay dargestellt (linkes Bild). Der zweite Schnitt wurde immunhistochemisch mit einem Primärantikörper gegen GFP gefärbt (rechtes Bild). Zusätzlich wurden die Zellkerne mit Hämatoxillin angefärbt. Die transplantierten Hepatozyten konnten hier zusätzlich zur Fluoreszenz durch eine zweite Methode identifiziert werden. Im histologischen Bild wird sichtbar, dass die transplantierten Zellen im Lebergewebe integriert sind und morphologisch gesundes Lebergewebe gebildet haben. Die Leber heterozygoter uPA/SCID-Mäuse wird auch durch wirtseigene Hepatozyten regeneriert, die das uPA-Transgen durch somatische Rekombination verloren haben. Daher ist auch um die Repopulationsareale herum gesundes Lebergewebe sichtbar. Ein geringer Anteil der Leber wurde wahrscheinlich auch durch nicht-transduzierte Zellen repopuliert, die mit diesen Methoden jedoch nicht identifiziert werden konnten.

4.5.3. Transplantation und Regeneration: RGB-markierte primäre humane