Isolation und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Die Isolierung von DNA-Plasmiden im kleinen Maßstab (Kulturvolumen 5 ml) wurde nach dem Protokoll des Herstellers Peqlab (peqGOLD Plasmid Miniprep I) durchgeführt. Die-ses Plasmid-Mini-Präparationskit kombiniert eine modifizierte alkalische Lyse mit den selektiven und reversiblen DNA-Bindungseigenschaften von Silikamembranen und di-verse Zentrifugationsschritte.

Des Weiteren wurde Plasmid-DNA durch alkalische Lyse mit SDS (Natriumdodecylsul-fat) Behandlung gewonnen. Dazu wurde 1 ml der Übernachtkulturen in ein Reaktionsge-fäß gegeben und 1 Minute bei 14.000 rpm Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Bakterienpellet in 150 µl Puffer 1 resuspendiert. Nun wurde die Suspension kräftig gevortext. Anschließend wurde 150 µl Puffer 2 dazugegeben und vorsichtig sechsmal geschüttelt. Die Zellen wurden durch das enthaltene Natriumhydro-xid (NaOH) und dem SDS alkalisch lysiert. Der Zusatz von 150 µl Puffer 3 bewirkt eine Neutralisierung, NaOH fällt zusammen mit Proteinen und genomischer DNA aus. Sicht-bar als ein weißes, flockiges Präzipitat. Nach einer 10 minütigen Zentrifugation bei 14.000 rpm Raumtemperatur wurde der plasmidhaltige Überstand mit dem zweifachen Volumen Ethanol bei Raumtemperatur präzipitiert. Es folgte ein weiterer Zentrifugati-onsschritt (10 Minuten, 14.000 rpm, 4°C). Der Überstand wurde verworfen und das Plasmid-Pellet unter Zugabe von 70% Ethanol gewaschen (Zentrifugation: 5 Minuten, 14.000 rpm, 4°C). Nach einem erneuten Waschschritt wurde das Ethanol entfernt und das Pellet bei 37°C etwa 5 Minuten getrocknet. Die Plasmid-DNA wurde in 40 µl TE

Puffer unter Zusatz von 100 µg/ml RNase aufgenommen und konnte in dieser Form bei -20°C gelagert werden.

Die Isolierung von Plasmiden im großen Maßstab (Kulturvolumen 500 ml) wurde mit Hilfe des QIAGEN^® Plasmid-Aufreinigungskits (Plasmid Maxi Kit) gemäß der Hersteller-angaben durchgeführt.

Puffer 1 50 mM Tris-HCl (pH 8)

10 mM EDTA (pH 8)

Puffer 2 200 mM NaOH

1% SDS (w/v)

Puffer 3 3 M Kaliumacetat (pH 5,5)

TE (Tris EDTA) Puffer 10 mM Tris-HCl (pH 8) 1 mM EDTA (pH 8)

3.2.3.2 Präparation genomischer DNA

DNA-Präparation aus murinen Gewebeproben für Southern Blot

Die Gewebeproben von adulten Tieren (100 mg) wurden nach der Entnahme direkt im 4 ml SNET Puffer gegeben und bei 55°C leicht schüttelnd über Nacht inkubiert. Die DNA-haltige Suspension wurde dann mit der Phenol:Chloroform Methode (siehe 3.2.3.5) auf-gereinigt. Dabei musste es vermieden werden, die DNA allzu großen Scherkräften und negativen Temperaturen auszusetzen, denn für die späteren Southern Blot Hybridisie-rungen war es wichtig, große DNA-Fragmente (10-30 kb) zu erhalten. Die Lagerung der genomischen DNA erfolgte bei 4°C.

SNET Puffer 20 mM Tris-HCl (pH 8)

5 mM EDTA (pH 8)

400 mM NaCl

1% SDS (w/v)

400 µg/ml Proteinase K

10 µg/ml RNase

DNA-Präparation von Embryonalen Stammzellen (ES) aus 96-well Platten

Zur Überprüfung der ES-Zellklone mittels PCR (siehe 3.2.5.4) und Southern Blot (siehe 3.2.5.6) musste aus den adhärent wachsenden Zellen DNA gewonnen werden. Zu-nächst wurde das Medium von der 96-well Platte abgesaugt und die Zellen mit 100 µl PBS pro Well gewaschen. Unter Gebrauch einer Mehrkanalpipette wurde 100 µl Zellly-sisreagenz zu den Zellen gegeben. Die Platte wurde anschließend mit einer Klebefolie versiegelt und bei 55°C über Nacht in einer feuchten Kammer inkubiert. Am nächsten Tag wurde zur die Fällung der DNA 10 µl 8 M LiCl und 100 µl Isopropanol dazu gegeben, versiegelt und abermals über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Platte wurde abzentrifugiert (30 min, 3500 rpm, 4°C), der Überstand entfernt und mit 200 µl eiskalten 70 % Ethanol gewaschen. Nach Entfernung des Überstands wurde die Zell-kulturplatte bei Raumtemperatur etwa 30 Minuten getrocknet. Anschließend konnte die DNA in 50 µl „low“ TE-Puffer gelöst werden (55°C, über Nacht, leicht schüttelnd).

Zelllysisreagenz 280 µg/ml Proteinase K 100 µg/ml RNase A

0,1% SDS

"low" TE-Puffer 10 mM Tris-HCl (pH 8) 0,5 mM EDTA (pH 8)

DNA-Schnellpräparation nach der HotSHOT-Methode

Zur schnellen und kostengünstigen Präparation von genomischer DNA aus Schwanz- oder Ohrlochbiopsien für Genotypisierungs-PCR wurde die HotSHOT (engl. „hot sodium hydroxide and Tris solution“) Methode angewandt [154]. Dazu wurden 2 mm Schwanz-spitze oder Gewebereste, die bei einer Ohrmarkierung anfallen, in 75 µl Lysisreagenz für

30 Minuten bei 95°C erhitzt. Danach wurden die Ansätze kurz runterzentrifugiert und mit 75 µl Neutralisationspuffer vermengt. Die Proben konnten sofort in einer PCR getestet werden.

Lysisreagenz 25 mM NaOH

0,2 mM EDTA pH 12

Neutralisationspuffer 40 mM Tris-HCl pH 5

3.2.3.3 Präparation von RNA aus Gewebe

Nach der Entnahme der Organe wurden diese sofort in RNA Later^® (Volumen richtete sich nach den Herstellerangaben) gesammelt und etwa 1 Stunde auf Eis stehen gelas-sen. Im Weiteren wurden die Proben bis zur RNA-Gewinnung bei -80°C aufbewahrt.

Die RNA wurde mit Hilfe einer Trizol^®-Extraktion (Reagenz aus Phenol, Chloroform und Guanidiniumthiocyanat) gewonnen [155] [156]. Dazu wurde das 100 mg Gewebe zu-sammen mit 1 ml Trizol^® mit einem Homogenisator zerkleinert und 5 Minuten bei Raum-temperatur inkubiert. Anschließend wurde 0,2 ml Chloroform dazugegeben und gut ver-mischt. Es folgte eine 15 minütige Zentrifugation bei 4°C (12.000 g), wobei die ausgefallene RNA pelletiert wurde. Dieses Pellet wurde mit 75% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in RNase-freiem Wasser gelöst.

Zur Aufreinigung der gewonnenen RNA wurde ein Kit von QIAGEN^® („RNeasy^® Mini Kit“) gemäß den Herstellerangaben (inklusive DNase Behandlung der Proben) genutzt. An-schließend konnte die gereinigte RNA in cDNA (siehe Punkt 3.2.5.3) umgeschrieben werden.

Besonderheit zur Präparation von Darmsegmenten: Weil Jejunum und Ileum für ein un-geübtes Auge sehr schwer zu unterscheiden sind, wurden am Beginn des Duodenums 10 cm abgemessen. Es erfolgte ein Schnitt. Nach weiteren 10 cm wurde erneut ge-schnitten. Anschließend wurde dieses Mittelstück abermals geteilt. Aus beiden Proben wurde cDNA hergestellt, die abschließend vermengt wurde. So konnte man davon aus-gehen, das sich in jeder Probe cDNA vom Ileum und Jejunum vorlag. Dieselbe Vorge-hensweise wurde auch bei der Isolation der Darmsegmente verwendet, die für die Prote-ingewinnung bestimmt waren.

3.2.3.4 Agarosegel-Elektrophorese

Die Agarosegel-Elektrophorese ist eine einfache Methode um Nukleinsäuren (0,1 bis 20 kb Länge) voneinander zu trennen und zu identifizieren. Die eingesetzte Agarosekon-zentration richtet sich nach der Größe der aufzutrennenden Fragmente. Zunächst wurde Agarose in der geeigneten Menge mit 1x Acetat-EDTA-Puffer (TAE) oder 1x Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE) in einer Mikrowelle zum Sieden gebracht und durch wiederhol-tes Schwenken aufgelöst. Nach dem Abkühlen auf etwa 60°C wurde 10 mg/ml

Ethidi-umbromid dazugeben und in eine horizontale Elektrophoresevorrichtung gegossen. Die aufzutragenden Proben wurden mit 1x Ladepuffer versetzt und in die vorgesehenen Gel-ladetaschen pipettiert. Parallel dazu wurde ein Molekulargewichtsstandard mitgeführt.

Die Elektrophorese erfolgte in 1x TAE bzw. 1x TBE bei 5 bis 20 V/cm, bei maximaler Stromstärke von 350 mA. Anschließend wurde das Gel auf dem UV-Transilluminator mit Hilfe eines Videosystems fotografiert.

10x TBE 890 mM Tris Base

890 mM Borsäure

20 mM EDTA (pH 8.0)

50x TAE 2 M Tris Base

1 M Essigsäure 100 mM EDTA (pH 8.0)

5x Ladepuffer 20% Ficoll 400^® (w/v) 50 mM EDTA

0,001% Orange G (w/v)

3.2.3.5 Aufreinigung und Konzentrierung von Nukleinsäuren Extraktion mit der Phenol:Chloroform Methode und Ethanolfällung

Eine Methode zur Aufreinigung von nukleinsäurehaltigen Lösungen ist die nol:Chloroform Methode. Dabei wurden die Proben mit dem gleichen Volumen Phe-nol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Rotation inkubiert. Es erfolgte eine Zentrifugation (1 Minuten, 14.000 rpm, 4°C).

Die obere, wässrige Phase, die die Nukleinsäuren enthält, wurde abgenommen und mit gleichem Volumen Chloroform, vermengt um eventuelle Reste von Phenol zu entfernen.

Nach einer weiteren Zentrifugation wurde die obere Phase in ein neues Reaktionsgefäß gegeben und präzipitiert. Die Lösung wurde mit einem halben Volumen Salz (7,5 M Am-moniumchlorid) und 3 Volumen eiskaltem Ethanol (100%) versetzt und für 20 Minuten bei -20°C oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde 30 Minuten bei 14.000 rpm, 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 70% eiskaltem Ethanol gewaschen (Zentrifugation: 5 Minuten, 14.000 rpm, 4°C) und abschließend 15 bis 20 Minuten an der Luft getrocknet. Anschließend konnte das Pellet in „low“ TE-Puffer (siehe Punkt 3.2.3.2), ggf. rotierend über Nacht bei 4°C, gelöst werden.

Aufreinigung mittels Filtersäulen

Die DNA-Fragmente aus Restriktionsansätzen oder PCR-Produkten, die für nachfolgen-de Klonierungsschritte, Squenzierungen onachfolgen-der Ligationen gereinigt vorliegen mussten, wurden auf einem Agarosegel aufgetragen. Nach der elektrophoretischen Auftrennung wurde mittels eines Skalpells die gewünschte Bande ausgeschnitten. Es bestand auch die Möglichkeit, die Fragmente direkt ohne Elektrophorese aufzureinigen. Die Aufreini-gung erfolgte in beiden Fällen durch ein Kit von Roche („High pure PCR product

purifica-tion kit“) nach den Herstellerangaben. Hierbei binden die Nukleinsäuren ab einer Größe von 100 bp in der Gegenwart von einem chaotrophen Salz (Guanidiniumthiocyanat) an eine Glasfaservlies-Fläche und werden durch diverse Waschschritte von Primerresten, Salzen und Enzymresten befreit.

3.2.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren