4.2 Maspin
4.2.7 Funktionelle Studien
4.2.7.7 Invasions-Assays
Um in Invasions-Assays den mit Matrigel beschichteten Filter zu überwinden, müssen die fwenden.
xprimierenden SW480 MS-Klone Zellen proteolytische Aktivität au
4.2.7.7.1 Invasivität der Maspin-übere
Wie bei den Migrations-Assays (siehe 4.2.8.6) bildeten die SW480 MS-Klone in n dadurch Konzentrationen über 30 000 Zellen/ml im Invasions-Assay Klumpen und wurde
immobil und nicht invasiv. Daher wurden in den folgenden Invasions-Assays 8000 Zellen/Kammer eingesetzt, was das Klumpen weitgehend verhinderte. Nun zeigten die SW480 MS-Klone durchschnittlich 5,50-fach höhere Invasionsraten als die Kontrolle. Durch die Zugabe von 25 µg anti-Maspin-Antikörper wurde der Anstieg der Invasivität bei den SW480 MS-Klonen auf den 1,69-fachen Wert der SW480 LP-AK -Kontrolle verringert. Die Invasivitätsraten der SW480 LP-Kontrolle wurden vom anti-Maspin-Antikörper um 17,9 % verringert, während sich die durchschnittliche Invasionsrate der SW480 MS-Klone durch die Antikörperzugabe um 69,3 % verringerte (Abb. 4.2.36; Tab. 4.2.10).
36
218 200
154
31
66 63 54
0 50 100 150 200 250 300
SW480 LP SW480 MS2 SW480 MS3 SW480 MS9
Zellen/GF
-AK
+25 µg AK/ml
Abb. 4.2.36: Invasivität der SW480 MS-Klone mit und ohne anti-Maspin-Antikörper. –AK: ohne anti-Maspin-Antikörper, +25 µg AK/ml: mit 25 µg anti-Maspin-Antikörper/ml Medium, GF:
Gesichtsfeld.
- Maspin-AK + 25 µg Maspin-AK/ml
SW480 LP 100,0% 82,1%
SW480 MS2 525,6% 183,9%
SW480 MS3 537,2% 144,4%
SW480 MS9 587,4% 178,5%
MWSW480 MSK 550,1% 168,9%
Tab. 4.2.10: Relative Invasivitätsraten der SW480 MS-Klone mit und ohne anti-Maspin-Antikörper (bezogen auf SW480 LP ohne anti-Maspin-anti-Maspin-Antikörper). AK: anti-Maspin-Antikörper, MW:
Mittelwert, MSK: MS-Klone.
4.2.7.7.2 Invasivität der Maspin-supprimierten SW48 AS-Klone
In Invasions-Assays zeigten die SW48 AS-Klone durchschnittlich 37,1 % weniger Invasion als die SW48 LP-Kontrolle, dabei war die mittlere Invasivität, bezogen auf die Kontrolle, bei SW48 AS I35 um 46,6 %, bei SW48 AS II43 um 28,9 % und bei SW48 AS II5 um 35,9 % verringert. Die Zugabe von 1 µM rMaspin führte bei allen SW48 AS-Klonen, im Vergleich zu entsprechenden unbehandelten Zellen, zu einer durchschnittlich 21%igen Zunahme der Invasivität. Die Zugabe von 1 µM Maspin erhöhte auch die Invasivität der Kontrolle um 5,6 %. Wurde die rMaspin-Konzentration auf 2 µM erhöht, verklumpten die Zellen, wodurch sich die Invasivität der SW48 AS-Klone, verglichen mit entsprechenden Zellen ohne Mediumzusätze, im Mittel um 75,3 % und die der Kontrolle um 78,6 % verringerte. Der klumpende Effekt des 2 µM rMaspin konnte durch die Zugabe von anti-Maspin-Antikörper (25 µg/ml) aufgehoben werden, da die Zellen nach Antikörperzugabe wieder vereinzelt vorlagen. Als weitere Wirkung des anti-Maspin-Antikörpers nahm die Invasivität der SW48
AS-Klone bezogen auf die entsprechenden unbehandelten Zellen um durchschnittlich 9,5 % ab, die Invasivität der Kontrolle fiel um 19,7 % (Abb. 4.2.37; Tab. 4.2.11).
0 50 100 150
SW48 LP SW48 AS I35 SW48 AS II43 SW48 AS II5
Zellen/GF
nur Medium + 1 µM rMaspin + 2 µM rMaspin
+ 2 µM rMaspin + 25µg anti-Maspin AK/ml
Abb. 4.2.37: Invasivität der SW48 AS-Klone unter dem Einfluss von rMaspin und anti-Maspin-Antikörper. GF: Gesichtsfeld, AK: anti-Maspin-Antikörper.
+ 2 µM rMaspin
nur Medium + 1 µM rMaspin* + 2 µM rMaspin* + 25µg anti-Maspin-Antikörper*
SW48 LP +0% +5,6% -78,6% -19,7%
SW48 AS I35 -46,6% +32,6% -71,7% +10,3%
SW48 AS II43 -28,9% +9,4% -78,2% -20,2%
SW48 AS II5 -35,9% +21,4% -76,0% -18,6%
MWSW48 ASK -37,1% +21,1% -75,3% -9,5%
*bezogen auf den entsprechenden Klon nur mit Medium
Tab. 4.2.11: Modulation der Invasivität der SW48 AS-Klone durch Zugabe von rMaspin bzw.
anti-Maspin-Antikörper (bezogen auf SW48 LP nur Medium). * bezogen auf den jeweils entsprechenden Klon nur Medium , GF: Gesichtsfeld.
4.2.7.7.3 Invasivität der Maspin-supprimierten SW48 siRNA-Transfektanden In den Invasions-Assays zeigten die SW48 siRNA-Transfektanden als Folge der Maspin-Suppression durchschnittlich nur 31,3 % der Invasionsrate der Kontrolle, dabei war die mittlere Invasivität, bezogen auf die Kontrolle, bei SW48 siRNA I 38,9 % und bei SW48 siRNA III 23,7 % (Abb. 4.2.38).
100%
39% 24%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
SW48 siKO SW48 siRNA I
SW48 siRNA III
Invasion relativ zu SW48 siKO
Abb. 4.2.38: Relative Invasivität der SW48 siRNA-Transfektanden (bezogen auf SW48 siKO).
4.2.7.8 5-Fluoruracil-Sensitivität
Da, wie in 4.2.6 beschrieben, die Maspinexpression und Lokalisation in CRC ein prädiktiver Marker für das Ansprechen auf eine 5-FU basierte Chemotherapie ist, wurde der Einfluss der Maspinexpression auf die 5-FU-Sensitivität analysiert. Dazu wurden die Klone mit verschiedenen 5-FU-Konzentrationen behandelt und der Anteil der überlebenden Zellen nach 72 h mit Hilfe eines XTT-Assays durch Vergleich mit unbehandelten Zellen bestimmt.
4.2.7.8.1 5-FU-Sensitivität der Maspin-überexprimierenden SW480 MS-Klone Alle SW480 MS-Klone zeigten im 5-FU-Konzentrationsbereich von 2,5 µM – 200 µM durchwegs höhere Überlebensraten bzw. niedrigere Sensitivitäten als die Kontrolle. Ab 50 µM 5-FU waren die mittleren Überlebensraten der überexprimierenden Klone doppelt so hoch wie bei der Kontrolle (Abb. 4.2.39).
Abb. 4.2.39 auf der folgenden Seite: Relative Überlebensraten der SW480 MS-Klone bei verschiedenen 5-FU-Konzentrationen (bezogen auf den jeweiligen Klon ohne 5-FU). Die Zahlen über den Klammern entsprechen den mittleren Überlebensraten der SW480 MS-Klone.
47%
4.2.7.8.2 5-FU-Sensitivität der Maspin-supprimierten SW48 AS-Klone
Da die SW48 AS-Klone sehr schnell proliferierten (siehe 4.2.7.5.2), wurde der Anteil der überlebenden Zellen mit Hilfe eines XTT-Assays schon nach 48 h und nicht nach 72 h, wie bei den SW480 MS-Klonen, durch Vergleich mit unbehandelten Zellen bestimmt. Weil aus den vorangegangenen 5-FU-Assays mit den SW480 MS-Klonen (siehe 4.2.7.8.1) bekannt war, dass der toxische Effekt von 5-FU ab Konzentrationen von 50 µM am größten ist, wurden bei den SW48 AS-Klonen 5-FU-Konzentrationen ab 50 µM getestet.
Dabei zeigten alle SW48 AS-Klone niedrigere Überlebensraten bzw. höhere Sensitivitäten als die Kontrolle. Bei 50 µM 5-FU waren die Überlebensraten der SW48 AS-Klone gegenüber der Kontrolle durchschnittlich um 19 %, bei 100 µM um 21 % und bei 200 µM um 26 % erniedrigt (Abb. 4.2.40).
Abb. 4.2.40 auf folgender Seite: Relative Überlebensraten der SW48 AS-Klone bei verschiedenen 5-FU-Konzentrationen (bezogen auf den jeweiligen Klon ohne 5-FU). Die Zahlen über den Klammern entsprechen den mittleren Überlebensraten der SW48 AS-Klone.
22%
4.2.8 Expressionsanalysen von Genen, die mit 5-FU-Sensitivität