Interpretation auf Proteinebene

Gegensatz dazu verlaufen die Graphen für das fer1 Gen der stationären Phase deutlich unterschiedlich. Das fer1 Gen ist bei phototrophem Wachstum stärker exprimiert und der Einsatz als Referenz ist nicht mehr möglich.

Jedoch zeigen die Resultate eindeutig, dass es bei einer Expressionsanalyse auf genau definierte Bedingungen bei der Kultivierung des biologischen Ausgangsmaterials ankommt, um eine Vergleichbarkeit der Transkriptmengen zu gewährleisten. Vor allem für die quantitative Beurteilung der Regulation bedarf es der exakten Standardisierung.

Trotz der unterschiedlichen biologischen und experimentellen Vorraussetzungen zeigt der Vergleich der RT-PCR Ergebnisse der RNA-Proben der mid-log Phase mit den Mikroarray-Experimenten eine Übereinstimmung in 15 Genen, was einer Quote von 68% entspricht. Dies bestätigt das Ergebnis der direkten Verifizierung des ersten Transkriptom-Experiments. Bei dem Anteil von 15 Genen sind auch 6 Gene enthalten, die bei den Mikroarray-Ergebnissen keine Regulation zeigen, also deren Werte zwischen 0,9 und 1,1 liegen.

Des weiteren konnte durch dieses Experiment eindeutig bestätigt werden, das der maximale Unterschied zwischen aeroben und phototrophen Bedingungen im RT-PCR-Experiment und im Mikroarray-Experiment auf dem gleichen Niveau liegen, was bedeutet, dass die Induktion z.B. des bop Gens für beide Methoden im selben Bereich liegt und die Regulation der Proteinexpression nicht nur auf der Transkriptionsebene abläuft. Man kann also abschließend sagen, dass durch die höhere Sauerstoffdurchlüftung zwar Unterschiede auf Transkriptebene bestehen, es aber nicht zu einer wesentlich stärkeren Induktion der untersuchten Gene kommt. Zum Vergleich der Ergebnisse dieser Arbeit mit früheren Experimenten ist es wichtig, genau über die experimentellen Wachstumsbedingungen und die Wachstumsphase der Zellen Bescheid zu wissen, um ausschließen zu können, dass eventuelle Abweichungen auf Unterschiede im Zeitpunkt der Probennahme zurückzuführen sind.

Eine Kombination der beiden Analyse Methoden kann einen großen Schritt zum Verständnis der Zusammenhänge der Regulation auf der RNA- und der Proteinebene bedeuten.

In den folgenden Abschnitten wird die Kombination der Ergebnisse der Transkriptom-Experimente und der Proteomanalyse von H. sal. R1 vorgestellt.

Die Ergebnisse der Proteomik beziehen sich auf die Arbeiten von Frau Birgit Bisle und Herrn Andreas Tebbe, die eine Analyse des Membran-Proteoms und der cytosolischen Proteine von H. sal. R1 vornehmen. Ziel auch dieser Arbeiten ist die Identifikation der Unterschiede zwischen der aeroben und der phototrophen Wachstumsbedingung.

In der Tab. 27 sind die Ergebnisse der Analyse der cytosolischen Proteine zusammengestellt, die auf den Experimenten von Herrn Andreas Tebbe basieren (Dr. Arbeit A. Tebbe).

Tab. 27: Liste der regulierten Gene der Proteomanalyse der cytosolischen Proteine vom Vergleich aerobes und phototrophes Wachstum kombiniert mit den Ergbnissen der Transkriptom-Experimente von H. sal. R1.

Gene der oberen Hälfte der Tabelle sind unter phototrophen Bedingungen reprimiert, die der unteren Hälfte induziert. (Quelle Promotion Andreas Tebbe) ZV = Zweigruppenvergleich; ZRI = erstes Zeitreihen Experiment; ZRII = zweites Zeitreihenexperiment. Der Farbkode ist in Tab. 26 aufgeschlüsselt.

Mit welchem Transkriptom-Experiment die Proteom-Daten übereinstimmen ist durch die Abkürzungen in der fünften Spalte von rechts angegeben, dabei beziehen sich die unterschiedlichenen Färbungen der Spalten darauf mit welchem Experiment eine Übereinstimmung besteht. Die Aufschlüsselung des Farbkodes ist in Tab. 28 gegeben.

Tab. 28: Aufschlüsselung des Farbkodes von Tabelle 27. Die Zahlen links geben die Anzahl der übereinstimmenden Gene pro Transkriptom-Experiment an.

Aus Tab. 28 ist zu entnehmen, dass 23 Gene aus den

Transkriptom-einem Anteil von 56% entspricht, wenn man eine Gesamtzahl von 41 regulierten Proteine nach der Proteomanalyse zugrunde legt.

Man findet drei Blöcke, die Übereinstimmungen der beiden Methoden aufweisen.

So werden in einem Block die Gene thi1, thiC und thiD, die an der Thiaminbiosynthese beteiligt sind, als übereinstimmend gefunden. Einen weiteren Block von übereinstimmenden Genen bilden die Gene cbiF, cbiG und cbiH2 die an der Biosynthese des Percorrins beteiligt sind. Und als dritter Block kann die Übereinstimmung für die Gene bat und crtI2 sowie der beiden Untereinheiten der Carbamoylsynthase carA und carB angesehen werden.

In die Liste der regulierten Gene der Proteomanalyse sind Gene aus der Transkriptomanalyse eingefügt worden, wenn sie in direkter Nachbarschaft mit einem Gen auf der Proteinliste stehen. Solche Einschübe von Genen in diese Listen könnte helfen die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern.

In der Liste der Membran-Proteomanalyse (Tab. 29) ist eine geringere Rate der Übereinstimmungen mit den Transkriptomdaten zu verzeichen. Dies liegt zum einen daran, dass diese Liste mehr regulierte Gene im Vergleich zu der Liste der cytosolischen Proteine enthält. Die Aufschlüsselung des Farbkodes und der Anzahl der Gene pro Transkriptom-Experiment ist in Tab. 30 enthalten.

Tab. 29: Liste der regulierten Gene der Proteomanalyse der Membranproteine vom Vergleich aerobes und phototrophes Wachstum kombiniert mit den Ergbnissen der Transkriptom-Experimente von H. sal. R1.

Gene der oberen Hälfte der Tabelle sind unter phototrophen Bedingungen reprimiert, die der unteren Hälfte induziert. (Quelle Promotion Birgit Bisle) ZV = Zweigruppenvergleich; ZRI = erstes Zeitreihen Experiment;

ZRII = zweites Zeitreihenexperiment. Der Farbkode ist in Tab. 28 aufgeschlüsselt.

Auch in dieser Liste sind Gene eingefügt worden, die nicht in der Liste der regulierten Proteine enthalten sind.

Das bop-Gen wird in allen drei Transkriptom-Experimenten und der Proteomanalyse als reguliert gefunden.

Die offensichtlichsten Übereinstimmungen werden bei Proteinen von ABC-Transport-Systemen gefunden. Hier zeigt sich der positive Effekt des Einfügens von Genen aus der Transkriptomanalyse, denn so vervollständigen sich die Informationen über die Mitglieder dieser Transportsysteme. Als Beispiele wären da die Gene pstB2 und dppC1 zu nennen, die in der Transkriptomanalyse detektiert wurden und in direkter Nachbarschaft mit den Genen pstA2 und dppD stehen, die in der Membranproteomanalyse gefunden wurden.

Die Rate der Überseinstimmungen, die der Tab. 30 zu entnehmen ist, liegt bei 14 Genen, was einem Anteil von 25,6% bei einer Gesamtzahl von 54 regulierten Membranproteinen entspricht.

Tab. 30: Aufschlüsselung des Farbkodes von Tabelle 25. Die Zahlen links geben die Anzahl der übereinstimmenden Gene pro Transkriptom-Experiment an.

Neben der Angabe über die Übereinstimmung enthält die Tab. 30 auch die Aufschlüsselung des Farbkodes für die Tab. 29.

Als Fazit dieser Kombination von Transkriptom- und Proteomdaten kann geschlossen werden, dass die Raten der Übereinstimmungen von 25,6% bzw.

56% im Hinblick auf die methodischen Unterschiede sehr groß sind.

Dieses Ergebnis zeigt ein weiteres Mal, dass die etablierte Methode der Transkriptomik verlässliche Ergebnisse liefert, die durch andere Methoden reproduziert werden können. Im Hinblick der Aufklärung der Regulation des phototrophen Wachstums stellt die Kombination von mehreren Gesamtgenomanalyse Methoden einen unschätzbaren Wert dar.