Bestimmung der Expressionsunterschiede

 A

E ∗ z µl ∗ Verdünnungsfaktor ∗ 10

A= Absorption Cy3 bei 550nm; Cy5 bei 650nm

E= Extinktionskoeffizent Cy3 (150000 lmol^-1 (bei 550nm)); Cy5 (250000 lmol^-1(650nm)) z µl= Volumen der cDNA nach der Reinigung

3.3.3 Diskussion

Die Basis für die Durchführung aller Transkriptomexperimente, egal welchen Designs, bildet die Qualität der gewonnen Gesamt-RNA von H. sal. R1. Es musste sichergestellt sein, dass die RNA-Proben keine Anzeichen einer Degradierung aufweisen. Denn durch degradierte RNA-Proben, entstünden beim Prozess der Fluoreszensmarkierung kleinere cDNA-Fragmente. Die ihrerseits maßgeblich für einen Anstieg der Hintergrundsignale verantwortlich (siehe 3.3.1.1) wären.

Die Qualität und gleichzeitig auch die genaue Konzentration der isolierten Gesamt-RNA wurde mit Hilfe des Bioanalyzers und der RNA 6000 Nano Chips der Firma Agilent untersucht. Der erhebliche Vorteil dieser Qualitätskontrolle besteht in dem geringen Probenvolumen und der parallelen Bestimmung der Quantität und Qualität der RNA. Ein Beispiel einer solchen Messung mit dem Bioanalyzer ist in Abb.27 gezeigt. Alle eingesetzten RNA-Proben haben diese Qualitätskontrolle durchlaufen und bestanden.

Eine sehr hohe Qualität der RNA ist zwar eine notwendige Voraussetzung für gute Ergebnisse, jedoch wurde auch die fluoreszensmarkierte cDNA vor jeder Hybridisierung einer Qualitätskontrolle unterzogen. Die Effizienz der Markierung wurde indirekt durch die photometrische Messung des noch freien Fluoreszensfarbstoffs im Reaktionsansatz kontrolliert (siehe .3.2.1).

3.4.1 Mikroarray-Hybridisierung

Zur Optimierung des Signal/Hintergrund-Verhältnisses wird vor jeder Hybridisierung eine Vorhybridisierung durchgeführt. Während der Vorhybridisierung werden die nicht bedruckten Flächen des Mikroarrays mit BSA („bovine serum albumin“ / Rinderserum Albumin) blockiert, damit es nicht zu unspezifischen Wechselwirkungen zwischen den markierten cDNAs und der Oberfläche kommt. Es ist allerdings zu beachten, dass es beim Prozess der Vorhybridisierung auch zu Kontaminationen der Arrays durch das verwandte BSA kommen kann. Für dieses Projekt zeigten die Vorhybridisierungen jedoch auf die Hybridisierungsergebnisse einen optimalen Erfolg: Es konnte gezeigt werden, dass es auf den nicht bedruckten Flächen des Mikroarray-Chips zu keinen unspezifischen Bindungen kommt, die das Signal/Hintergrund-Verhältnis beeinflussen.

Eine längere oder intensive Exposition der hybridisierten Mikroarray-Chips mit Tageslicht, wurde vermieden, weil die Fluoreszenzfarbstoffe ausbleichen können was zu einem Signalverlust führen würde.

3.4.2 Bildakquisition der Mikroarray-Chips

Die Signalintensitäten wurden nach der Hybridisierung der DNA-Mikroarrays mit Hilfe des GenePix™ 4000B Mikroarray Scanners (Axon Instruments) ausgelesen.

Dabei werden nach Laser-Anregung (532 nm (Cy3); 635 nm (Cy5)) die emittierten Photonen simultan für die beiden Fluoreszenzfarbstoffe Cy3 und Cy5 detektiert und die Intensitäswerte als 16-bit Bilddateien gespeichert. Diese so erhaltenen Dateien stellen die Rohdaten jedes Mikroarrayexperimentes da.

Nach erfolgter Optimierung der Quantifizierung der Fluoreszenzsignale werden alle Mikroarrays eines Transkriptom-Experimentes mit diesen Einstellungen ausgelesen (siehe experimenteller Teil). So soll vermieden werden, dass aufgrund unterschiedlicher Lasereinstellungen in den späteren Ergebnissen Artefakte entstehen.

3.4.3 Bildanalyse der Mikroarray-Chips

Der Ablauf der Bildanalyse ist ebenfalls festgelegt und genau im experimentellen Teil beschrieben. An dieser Stelle wird deshalb nur kurz auf die Methode der Bildanalysesoftware zur Hintergrundbestimmung eingegangen.

Die Klassifizierung der Pixelwerte einer Gensonde („spot“) in Vordergrund- oder Hintergrundwerte erfolgt durch Festlegung einer Kreisfläche, deren Mittelpunkt im Zentrum des „spots“ der entsprechenden Gensonde liegt. Der Durchmesser dieser Kreisfläche ist dreimal so groß, wie der Durchmesser des „spots“ selbst.

Alle Pixelwerte dieser Region werden zur Bestimmung des lokalen Hintergrundwertes benutzt, mit Ausnahme von:

• den Pixelwerten der benachbarten „spots“

• den Pixelwerten einer Zwei-Pixel-Ausschluss-Region

• den Pixelwerten innerhalb des „spots“ des entsprechenden Gens selbst.

Abb. 28: Darstellung zur Bestimmung des lokalen Hintergrundsignals mit Hilfe der Software GenePix^TM Pro 4.0. A) Bild des GenePix^TM 4000B Mikroarray Scanners. B) Screenshot der Bildanalyse-Software mit einem berechneteten Verhältnisbild. C) Schematische Darstellung einer Vergrößerung eines Bereichs von 9 Gensonden zur grafischen Beschreibung der Festlegung des lokalen Hintergrundwertes einer Gensonde.

Farbige Kreise stellen die Gensonden dar. Ein dunkelgrauer Kreis um Gensonde ist die Aussschlussregion und die schwarze Fläche entspricht dem Hintergrund der jeweiligen Gensonde.

Die Software GenePix™ Pro 4.0 bestimmt den Durchmesser zur Festlegung des Bildpunktdurchmessers einzeln für jeden Punkt auf dem Mikroarray nach der Methode der „adaptive circle segmentation“. Das bedeutet, dass die Software automatisch den Durchmesser eines „spots“ variiert und somit zwischen großen und kleinen „spots“ auf dem Mikroarray unterscheiden kann. Der anzupassende

Durchmesser wird durch das Layout des Mikroarrays festgelegt und damit auch durch die Array-Liste (GAL-Datei). Nachteil dieser „adaptive circle segmentation“

ist, dass sie für exakt kreisrunde „spots“ auf dem Mikroarray-Slide optimale Ergebnisse liefert, während z.B. oval geformte Punkte nicht einwandfrei berücksichtigt werden können. Aufgrund der hohen Qualität, der für dieses Projekt hergestellten Mikroarray-Slides ist der überwiegende Anteil von 90-92%

der Punkte kreisförmig, weshalb der Algorithmus des „spot finding“ Prozesses zu verlässlichen Ergebnissen führt.

Die Ergebnisse der automatischen Bildanalyse werden in einer Ergebnistabelle festgehalten und stellen zusammen mit den 16-bit Bilddateien der beiden Fluoreszenzfarbstoffe (Cy3/Cy5) die Rohdaten der Mikroarray-Experimente dar.

Zur weiteren Datenanalyse bzw. zur statistischen Auswertung in der Programmumgebung R werden die erzeugten Tabellen als Textdateien exportiert.

Der Ablauf und die einzelnen Schritte der Datenanalyse werden in dem Abschnitt 4. näher erklärt.

3.4.5 Datenanalyse

Die statistische Auswertung der Hybridisierungsdaten der Transkriptom-Analyse von H. sal. R1 wurde in Kooperation mit Dr. Gerhard Welzl (GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, GmbH) und Dr. Jobst Landgrebe (Universität Göttingen) durchgeführt. Dabei wurde, neben neuen R-Funktionen, im Wesentlichen das R/MAANOVA-Paket benutzt. R/MAANOVA ist eine erweiterbare, interaktive R Umgebung, die speziell für Mikroarray-Analysen entwickelt wurde. Die Abkürzung MAANOVA steht für „MicroArray Analysis Of VAriance“(www.jax.org/staff/churchill/labsite/software/ anova/ rmaanova/ ).

Eine beispielhafte Beschreibung des Ablaufs der statistischen Auswertung, erfolgt in Abschnitt 4. Der präzise Ablauf ist im experimentellen Teil zu finden.

3.4.6 Diskussion

Die Prozesse der Hybridisierung, der Bildakquisition und Analyse dieser Arbeit basieren auf etablierten Abläufen bzw. Methoden. Deshalb wird im folgendenem Abschnitt etwas zur computergestützten Bildakquisition angemerkt.

Die Detektion der Fluoreszenssignale erfolgte mittels des GenePix 4000B Mikroarray Scanners, der durch das Programm GenePix Pro 4.0 gesteuert wird

(siehe 3.4). Wichtig ist dass die Software einen so genannten “adaptive circle segmentation” Algorithmus verwendet (siehe 3.4.3). Damit ist die Software im Stande automatisch die Größe des auszuwertenden “spots” anzupassen. Diese Anpassung an die vorkommenden unterschiedlichen Größen der “spots” ist bei einem Transkriptomexperiment ein wichtiger Schritt und sollte deshalb nur in Ausnahmefällen manuell korrigiert werden. Denn alleine eine automatisch ablaufende Detektion der Signale, garantiert reproduzier- und nachvollziehbare Ergebnisse. Zum Ende dieser Arbeit stand eine überarbeitete Version der Bildanalysesoftware zur Verfügung, die neben dem “adaptive circle” auch den

“adaptive shape” Algorithmus zur Auswahl hat. Mit Hilfe des “adaptive shape”

Algorithmus kann Pixel genau die Form des “spots” ermittelt werden, wodurch die Bildanalyse verfeinert werden kann. Die Rohdaten für alle in dieser Arbeit beschriebenen Transkriptomexperimente, sind mit der Software Version 4.0 erhoben worden. Für einen Vergleich der beiden Bildanalysemethoden, müssten die Mikroarray-Bilddaten ein erneutes Mal bearbeitet werden. Dieser Punkt fällt damit in den Bereich der möglichen Schritte zur Prozessoptimierung (Bowtell D und Sambrook J, 2003).

Im vorliegendem dritten Abschnitt wurden alle Abläufe eines DNA-Mikroarray-Experimentes beschreiben, die im Labor ablaufen.

Der folgende vierte Abschnitt befasst sich mit den Schritten, die computergestützt ablaufen und enthält die Beschreibung der Auswertung der erhaltenen Rohdaten.