Interpretation der Genomdaten

Bei Analysen der Genomdaten von I. hospitalis wurden 8 ORFs annotiert, deren Sequenzen verschiedenen Untereinheiten einer A1AO ATP-Synthase zugeordnet werden konnten (Podar et al., 2008). Die zugehörigen Gene lagen weit über das Genom verteilt vor, und nicht zusammengefasst in einem Operon (Abb. 7A, B). Zusätzlich wurde das Protein Igni1215 als Bestandteil des angereicherten ATP-Synthase-Komplexes analysiert und als Untereinheit H identifiziert (Röhl, 2010).

Alle annotierten Untereinheiten wurden bis dato entweder mittels MALDI-TOF MS/MS oder Western-Blot nachgewiesen (Burghardt, 2008; Röhl, 2010). Die Ergebnisse zeigten, dass die A1AO

ATP-Synthase von I. hospitalis der klassischen Untereinheitenkomposition bekannter archaeeller ATP-Synthasen (Lingl et al., 2003; Pisa, 2008) gleicht. Aufgrund unzureichender Daten bezüglich der Struktur crenarchaeeller ATP-Synthasen wurde für die ATP-Synthase von I. hospitalis vorerst ein theoretisches Modell, basierend auf der Struktur der ATP-Synthase von P. furiosus (Vonck et al., 2009), erstellt (Abb 7C).

Weitere bioinformatische Analysen mit SignalP und Pred-Signal konnten ausschließlich für die membranständige Untereinheit K(c) eine SEC-spezifische Signalsequenz nachweisen. Die wahrscheinlichste Spaltstelle wurde zwischen Alanin³¹ und Alanin³² vorhergesagt (Abb. 8).

Demzufolge besteht das prozessierte Protein aus zwei transmembranen, hydrophoben Helices, die über eine kurze hydrophile Schleife miteinander verbunden werden (TMHMM 2.0). Die resultierende molekulare Masse von etwa 8 kDa (81 AS) und die einfache Haarnadelstruktur entsprechen den Charakteristika der meisten bakteriellen wie auch archaeellen c-Monomere (Müller et al., 2005). Allerdings muss die molekulare Masse der prozessierten c-Untereinheit erst noch biochemisch verifiziert werden. Ein Sequenzvergleich der K(c)-Untereinheit von I. hospitalis

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Abb. 6: Einfluss unterschiedlicher Hemmstoffe und Hemmstoffkonzentrationen auf die ATP-Synthese von I. hospitalis Zellen

mit verschiedenen archaeellen und bakteriellen 8 kDa c-Monomeren ergab, dass das Protein mit größter Wahrscheinlichkeit zur Protonentranslokation fähig ist. Die zur Na⁺-Translokation erforderliche Triade aus Q/E (Motiv I) und ET oder ES (Motiv II) (Meier et al., 2005; von Ballmoos et al., 2008) ist in der Sequenz des Proteolipids von I. hospitalis nicht vollständig konserviert (Abb. 8).

Zwar ist Motiv II (E⁹⁶ T⁹⁷) vorhanden, dennoch fehlt das entscheidende Motiv I (Q/E⁶⁷), so dass eine exklusive Translokation von Protonen wahrscheinlicher ist.

Abb. 7: Übersicht der Genomdaten für die ATP-Synthase von I. hospitalis. (A) schematische Darstellung der Genanordnung; (B) tabellarische Auflistung aller zugehörigen Untereinheiten; (C) schematische Darstellung des theoretischen Modells der ATP-Synthase von I. hospitalis (angelehnt an Vonck et al., 2009)

Abb. 8: Multiples Alignment archaeeller und bakterieller Aminosäuresequenzen von c-Untereinheiten der jeweiligen ATP-Synthase-Komplexe. Gelbmarkierte AS sind Teil einer identifizierten Signalsequenz; die für das Na⁺-Bindemotiv entscheidenden AS sind durch die Kästen (Motiv I und II, rot) gekennzeichnet.

Gen: Locus-Tag AS kDa Leserichtung

atpA Igni_1305 596 66,7 ←

atpB Igni_0679 471 52,3 →

atpC Igni_1214 341 38,0 ←

atpD Igni_0680 214 25,1 →

atpE Igni_1080 208 23,8 ←

atpF Igni_1081 102 11,0 ←

atpH Igni_1215 113 11,2 ←

atpI Igni_0609 654 74,3 ←

atpK Igni_0682 113 11,2 →

K(c) I(a)

C D HF EB A

A

B C

2.2. Solubilisierung

Detergenzien verschiedener Detergenzklassen (nicht-ionisch: TritonX-100, DDM; zwitterionisch:

CHAPS; ionisch: DOC) wurden auf ihre Eignung zur vollständigen Solubilisierung der hydrophoben Untereinheiten des AO-Subkomplexes getestet. Dabei war entscheidend, dass die funktionelle Kopplung des Gesamtkomplexes erhalten wurde. Die Wirksamkeit der Detergenzien wurden stets bei einem konstanten Verhältnis von Protein zu Detergenz untersucht (1 : 1,5). Zusätzlich wurde der Einfluss unterschiedlicher Detergenzkonzentrationen (0,5 %, 1 %, 2 % und 3 % (w/v)) und Inkubationstemperaturen (19 °C und 40 °C) auf die Solubilisierungseffizienz analysiert. Die charakteristischen Eigenschaften verschiedener Detergenzien können zu einer unterschiedlichen Effizienz und gegebenenfalls zur Dissoziation der Untereinheiten des Komplexes führen (Le Maire et al., 2000; Garavito & Ferguson-Miller, 2001; Seddon et al., 2004). Als Maß für die Solubilisierungseffizienz wurde die ATP-Hydrolyseaktivität und folgend die Hemmung durch den Inhibitor DCCD herangezogen. Der Hemmstoff DCCD ist lipophil und bindet kovalent an saure Aminosäuren, was im Falle einer Bindung an essentielle Aminosäuren des c-Rings (Aspartat und Glutamat) die Ionentranslokation verhindert und somit zur Inhibierung der Aktivität des Gesamtkomplexes führt. Folglich beweist die Hemmung der Aktivität mittels DCCD, dass die Mehrheit der A1AO-Gesamtkomplexe funktionell gekoppelt vorliegt, und das Enzym bis zu diesem Schritt der Reinigung nicht in A1 und AO-Teil dissoziierte.

Für die Versuchsreihen wurde die Membransuspension (Aspez = 1,9 U/mg) auf 2 mg/ml verdünnt und 1 ml in jeden Test eingesetzt. Generell führten die Detergenzien nicht zu einer Inaktivierung des Enzyms. Im Fall von DDM, TritonX-100 und DOC konnte sogar, wie auch bei Solubilisierungsversuchen mit M. jannaschii und P. furiosus (Lingl, 2006; Pisa, 2008), eine Stimulierung der Hydrolyse-Aktivität beobachtet werden. Die Solubilisierungseffizienz der verschiedenen Detergenzien veränderte sich nur marginal durch die Variation der Inkubationstemperatur oder der Detergenzkonzentrationen. Beispielhaft für die Effizienz der gewählten Detergenzien unter den getesteten Bedingungen ist Tabelle 1. Grundsätzlich waren die Versuche mit DDM und TritonX-100 am effektivsten. Konnten hier 83 %, respektive 81 % der Gesamtaktivität aus der Membran herausgelöst werden, waren es bei CHAPS nur 58 %. Mit DOC wurden zwar 82 % der Aktivität solubilisiert, allerdings war durch DOC auch die stärkste Stimulation zu verzeichnen, so dass die im MnS (Membran nach Solubilisierung) verbleibende Aktivität deutlich höher war als bei DDM oder TritonX-100. Die funktionelle Kopplung im Solubilisat wurde in jedem Ansatz mittels DCCD kontrolliert. In jedem Fall war eine DCCD-Hemmung der ATP-Hydrolyse zu verzeichnen. Das Ausmaß der Hemmung wurde für die unterschiedlichen Detergenzien in Relation gesetzt, eine quantitative Bestimmung wurde jedoch nicht durchgeführt. Die beste Hemmung war bei TritonX-100 zu beobachten, gefolgt von DDM, DOC und CHAPS. Die Tests belegten, dass der funktionelle A1AO-Gesamtkomplex durch alle Detergenzien herauszulösen war. Die Effizienz von DDM und TritonX-100 übertraf dabei aber die von DOC und CHAPS.

Basierend auf diesen Ergebnissen und auf Erfahrungswerten aus der Literatur (Schimerlik, 2001;

Schägger, 2003; Reisinger & Eichacker, 2008) wurde die Solubilisierung mit DDM (2 % (w/v); 2,5 h;

19° C) als Methode der Wahl angesehen. Auch hinsichtlich geplanter Kristallisationsstudien war

DDM das Detergenz mit den vielversprechendsten Erfolgsaussichten (mündliche Mitteilung Dr.

Guohong Peng, MPI, Frankfurt am Main).

Tabelle 1: Solubilisierungseffizienz

ATP-Hydrolyseaktivität

Detergenz Membran Sol MnS Sol + MnS Ausbeute

[mU] [%] [mU] [%] [mU] [%] [mU] [%]

DDM 3800 100 3154 83 798 21 3952 104

TritonX-100 3800 100 3078 81 1102 29 4180 110

CHAPS 3800 100 2204 58 1520 40 3724 98

DOC 3800 100 3116 82 1368 36 4484 118