Interaktion von E4 ORF 3 und p300 in vivo

Auf der Suche nach weiteren zellulären Interaktionspartnern von E4^ORF3 konnte in unserer Arbeitsgruppe das PML NB-assoziierte Protein p300 identifiziert werden (Täuber, 2002).

Zusammen mit CBP gehört p300 zu einer Familie zellulärer Transkriptionskofaktoren, die einer Vielzahl verschiedener zellulärer Transkriptionsfaktoren, wie den Steroid-Hormon-rezeptoren (Kamei et al., 1996), c-Jun (Bannister et al., 1995), Fos (Bannister und Kouzarides, 1995), p53 (Avantaggiati et al., 1997; Lill et al., 1997a; Gu et al., 1997) und NFκB (Merika et al., 1998; Zhang et al., 1998) als Plattformen dienen und dadurch Inter-aktionen zwischen diesen Transkriptionsfaktoren und den Komponenten des basalen Trans-kriptionsapparates ermöglichen. Beide Proteine vermitteln als Antwort auf externe Stimuli eine spezifische transkriptionelle Aktivierung von Zielgenen durch ihre Histon-azetyltransferase (HAT)-Aktivität. Der Einfluss der beiden Proteine auf zelluläre Trans-kriptionsvorgänge wird durch die Azetylierung von Histonen und Nicht-Histon-Proteinen ver-mittelt. Während diese Modifikation der Histon-Proteine die Chromatinstruktur verändert, führt die Azetylierung von p53 beispielsweise (Gu et al., 1997) zu einer erhöhten DNA-Affinität in vitro (Sakaguchi et al., 1998) und einer erhöhten Stabilität des Tumorsuppressors

(Ito et al., 2001). Dies resultiert in einer Steigerung der p53-Transkriptionsrate in vivo (Lill et al., 1997; Gu et al., 1997; Avantaggiati et al., 1997; Barlev et al., 2001; Espinosa et al., 2001) und bewirkt letztlich eine verstärkte Transkription von p53-kontrollierten Genen. Wie die Aktivierung von p53 bereits andeutet, spielen p300 und CBP bei der Regulation der zellulären Wachstumskontrolle eine wichtige Rolle, was auch durch die Tatsache unterstrichen wird, dass beide Proteine tumorsupprimierende Eigenschaften besitzen und prominente Ziele von viralen Onkoproteinen darstellen (Abb.A.4).

Die Immunpräziptiationsversuche im Rahmen dieser Arbeit zeigen, dass das Ad5 E4^ORF 3-Protein vermutlich über seinen Aminoterminus mit p300 interagiert (C.11). Für diese Wech-selwirkung scheint insbesondere das NES-Signal seitens des viralen Proteins verantwortlich zu sein. Aminosäureaustausche in dieser Region führen zu einer deutlichen Abnahme, aber keineswegs zum vollständigen Verlust der Interaktion zwischen dem E4-Protein und p300.

Frühere In-vitro-Bindungsanalysen konnten belegen, dass der Aminoterminus (AS 1 bis 28) für eine direkte Interaktion zwischen E4^ORF3 und p300 notwendig ist (Täuber, 2002).

Die Interaktion zwischen p300 und der NES-Region von E4^ORF3 könnte daher die Ursache für die überwiegende nukleäre Lokalisation des viralen E4-Proteins sein. Proteine, die eine NESDomäne aufweisen, sind in der Lage, mit zellulären Exportproteinen (z.B. Crm1) und -faktoren zu interagieren (Bray et al., 1994; Fischer et al., 1994; Pollard und Malim, 1998) und dadurch den Transport viraler Transkripte aber auch die eigene Translokation ins Zytoplasma zu vermitteln. Durch die Bindung von p300 an E4^ORF3 wird möglicherweise das Leucin-reiche Exportsignal maskiert. Infolgedessen befindet sich nur ein geringer Anteil des viralen Proteins im Zytoplasma in Form der zellkernnaher Strukturen, die neuerdings als Aggresome bezeichnet werden (Ajauro et al., 2005). Mutationen innerhalb dieses Signals schwächen dagegen die Bindung an p300. Dennoch ist eine Retention von E4^ORF3 NES im Zellkern zu beobachten, da diese Mutante über kein funktionierendes Exportsignal mehr verfügt. Dies zeigt sich auch anhand von Immunfluoreszenz-Analysen, die belegen, das E4^ORF3 NES wesentlich ausgeprägtere E4^ORF3-typische Strukturen im Zellkern ausbildet als das Wildtyp-Protein, während es im Zytoplasma nahezu vollständig verschwunden ist (Abb.C.7).

Die Vermutung liegt nahe, dass neben einer direkten Wechselwirkung von E4^ORF3 mit p300 auch indirekte Interaktionen zwischen Beiden durch noch unbekannte zelluläre Faktoren ver-mittelt werden (Abb.D.1). Dies wird durch die Tatsache unterstrichen, dass E4ORF3 L103A, das in früheren In-vitro-Studien nur schwach an p300 bindet, in vivo in Hinblick auf die Inter-aktion mit p300 keinerlei Defekte im Vergleich zum Wildtyp-Protein aufweist.

Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass E4^ORF3 nicht nur an den Aminoterminus und die CH3-Domäne bindet, sondern auch mit anderen Regionen innerhalb von p300 interagiert (Abb.D.1A). Denn die Mutante K8R, die nicht mehr am einzigen Lysinrest azetyliert werden kann, zeigt nur noch eine schwache Bindung an p300. Frühere Untersuchungen konnten jedoch zeigen, dass p300 und andere HAT-Enzyme (P/CAF; GCN5, TAFII250) über eine zentrale Bromodomäne (Haynes et al., 1992; Jeanmougin et al., 1997) verfügen. Diese Domäne ist in der Lage, an Azetyl-Lysinen verschiedener zellulärer und viraler Faktoren (Histone, p53, HIV-1 Tat) zu binden (Dhalluin et al., 1999b; Col et al., 2001; Dyson et al., 2001; Mujtaba et al., 2002). Auch eine direkte Interaktion mit dem E4^ORF3-Protein über die Bromodomäne von p300 ist daher denkbar.

Abb.D.1: Funktionell wichtige Bereiche für die Interaktion zwischen E4ORF3 und p300

Dargestellt sind die Interaktionsregionen von p300 (A) und von E4^ORF3 (B). (A) Innerhalb von p300 konnten mit Hilfe von In-vitro-Bindungsstudien bereits der Aminoterminus (As 1 bis 435) und ein carboxyterminaler Bereich (As 1.640 bis 2.219) identifiziert werden, welche die Interaktion von p300 und E4ORF3 vermitteln (Täuber, 2002). Aufgrund der Azetylierung von E4ORF3 und dessen negativer Einfluss auf die Histonazetylierung ist davon auszugehen, dass E4ORF3 auch mit der HAT- bzw. der Bromodomäne von p300 interagiert. (B) Seitens des E4O^RF3-Proteins ist sowohl der Aminoterminus (hellgraues Rechteck) als auch der Carboxyterminus (dunkelgraues Rechteck) für die Wechselwirkung mit p300 verantwortlich. Während die Interaktion mit p300 direkt über die NES-Region von E4ORF3 erfolgt und durch die Azetylierung von E4ORF3 verstärkt wird, vermittelt das Leucin¹⁰³ von E4ORF3 lediglich eine indirekte Interaktion mit dem Transkriptionskoaktivator p300. CH1, CH2, CH3: Cystein-Histidin-reiche Zinkfingermotive; BR:

Bromodomäne; HAT: Histonazetyltransferase; NES: nukleäres Exportsignal; NR: nukleärer Hormonrezeptor.

Die Zahlen unterhalb des E4ORF3- bzw. p300-Proteins geben die Position der entsprechenden Domänen an.

Im Einklang früherer Arbeiten machen diese Ergebnisse deutlich, dass die Interaktion zwischen E4^ORF3 und p300 sehr komplex ist. Diese Wechselwirkung schließt nicht nur ver-schiedene Domänen von p300, sondern auch unterschiedliche Regionen seitens des E4^ORF 3-Proteins mit ein. Demzufolge ist es wahrscheinlich, dass die von Täuber beschriebene Inter-aktion mit dem Aminoterminus und der CH3-Region (Täuber, 2002) sowie der Bromodomäne von p300 auf unterschiedliche Weise erfolgt: entweder direkt über den Aminoterminus von E4^ORF3 (NES, K8) oder indirekt über die (zeitlich regulierte) Interaktion mit unter-schiedlichen zellulären Faktoren an verschiedenen Stellen des E4^ORF3-Proteins.