Identifizierung funktioneller Bereiche des Ad5 E4 ORF 3-Proteins mittels Mutationsanalysen

Zur genaueren Analyse der Funktionen von Ad5 E4ORF3 in der Transformation und zum Nachweis funktionell relevanter Bereiche des E4ORF3-Polypeptids wurden gezielt Amino-säureaustausche innerhalb des E4^ORF3-Proteins vorgenommen. Dazu erfolgten in erster Linie Austausche von Aminosäuren, die in fast allen bisher bekannten E4^ORF3-Proteinen verschiedener Serotypen hoch konserviert sind (Abb.C.1).

Abb.C.1: Aminosäurevergleich von E4ORF3-Polypeptiden verschiedener Serotypen

Grafische Darstellung der Aminosäuresequenzen der Serotypen Ad2, Ad5, Ad9, Ad11, Ad12, Ad17, Ad35 und Ad40, welche unterschiedlichen Subgruppen (A bis D, F) angehören. Konservierte Bereiche sind hier schwarz hinterlegt. Die Aminosäuresequenz von Ad5 E4ORF3 ist mit roten Buchstaben dargestellt, die Amino-säureaustausche in der Ad5 E4ORF3-Sequenz sind mit roten Sternchen markiert. NES: nukleäres Exportsignal.

Gezielte Aminosäureaustausche gegen Alanin in der E4^ORF3 Wt-Sequenz lieferten die E4^ORF3-Varianten L13A, EE52/53AA, N82A (Stracker et al., 2002) und T96A sowie L103A, L106A, L111A und L115A.

Da bislang für das E4^ORF3-Protein weder Modifizierungen (Phosphorylierung, Azetylierung, SUMOylierung) noch bekannte Protein-Motive beschrieben sind, wurde in einem weiteren Ansatz Aminosäuren und -sequenzen innerhalb von Ad5 E4^ORF3 so moduliert, dass mögliche Orte für posttranslationale Modifizierungen oder putatitive Protein-Motive zerstört wurden.

Die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen innerhalb der Ad5 E4^ORF3-Sequenz erfolgte mit Hilfe des Programms NetPhos 2,0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos;

Blom et al., 1999). Die Analyse ergab eine mögliche Phosphorylierung des Tyrosins an Position 40 (Y40) mit einem Wert von 0,78 auf einer Skala von 0 bis 1. Alle anderen in der Sequenz enthaltenen Tyrosine (Y62), Threonine (T18, T81, T96) und Serine (S60, S87) blieben jedoch unter den vom System als signifikant angegebenen Schwellenwert von 0,5 und werden daher mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit nicht phosphoryliert (Abb.C.2). Durch den gezielten Austausch des Tyrosins gegen Alanin (Y40A) sollte daher keine Phosphorylierung des E4ORF3-Proteins mehr möglich sein.

Abb.C.2: Vorhersage potenzieller Phosphorylierungsstellen innerhalb von Ad5 E4ORF3 mit Hilfe des Programms NetPhos 2,0

Darüber hinaus befinden sich am Aminoterminus von Ad5 E4ORF3 mehrere Leucine und hydrophobe Aminosäuren, die aufgrund ihrer Anordnung der Konsensus-Sequenz eines nukleären Exportsignals (NES) L Xn (F; I; L; V; M) Xn L X (I; L) (n = 2 bis 3; die meisten der

Leucine können durch hydrophobe Aminosäuren ersetzt werden) (Bogerd et al., 1996;

Henderson und Eleftheriou, 2000) entsprechen. Proteine, die eine NES-Domäne aufweisen, sind in der Lage, wie bereits 1994 von Meyer und Malin anhand des HIV-1 Rev-Proteins gezeigt wurde (Meyer und Malim, 1994), mit zellulären Exportproteinen (z.B. Crm1) und -faktoren zu interagieren (Bray et al., 1994; Fischer et al., 1994; Pollard und Malim, 1998) und dadurch den mRNA-Transport aber auch die eigene Translokation ins Zytoplasma zu vermitteln. Falls es sich bei diesen hydrophoben Aminosäuren tatsächlich um ein Crm1-abhängiges Exportsignal handelt, sollte deren gezielte Austausch (I16, M19, L22, I24) gegen Alanin eine stärkere Akkumulation von E4^ORF3 im Zellkern zur Folge haben.

Schließlich zeigt die Ad5 E4ORF3-Sequenz eine auffallende Ähnlichkeit zu den Aminosäuresequenzen von Ubiquitin (Schlesinger et al., 1975) und den Ubiquitin-ähnlichen Proteinen SUMO-1, SUMO-2, SUMO-3, ISG15 und NEDD8 (zur Übersicht: Welchman et al., 2005). Insbesondere besitzt E4ORF3 ebenso wie diese zellulären Faktoren ein möglicherweise funktionelles GG-Motiv am Carboxyterminus. Nach der proteolytischen Spaltung dieses Motivs durch spezifische Hydrolasen wird Ubiquitin oder eines der Ubi-quitin-ähnlichen Proteine über den nun freien Glycinrest in einem mehrstufigen, ATP-abhängigen Prozess mittels Isopeptid-Bindung an einem Lysinrest des Zielproteins gebunden.

Da Ubiquitin durch Lysin⁴⁸ auch als Zielprotein fungieren kann, ermöglicht es die Bindung weiterer Ubiquitin-Moleküle und somit die Bildung von Polyubiquitinketten (Pickart, 1997).

Die Ubiquitinylierung dient vorrangig als Signal für den Abbau verschiedener Zielproteine über das 26S Proteasom (Rechsteiner, 1987; Bonifacino und Weissman, 1998; Hershko und Ciechanover, 1998).

Am Aminoterminus von E4^ORF3 (Abb.C.3) befindet sich eine putative SUMO-1 Konjugationsstelle ΨKXE; Ψ steht für eine hydrophobe Aminosäure (Puntervoll et al., 2003;

Seeler und Dejean, 2003; Xu et al., 2004). Eine solche Konjugationsstelle wird auch für die Ubiquitin-ähnlichen Faktoren SUMO-2 und SUMO-3 und einer Vielzahl weiterer zellulärer Proteine (RanGAP1, p53, PML) beschrieben (zur Übersicht: Melchior, 2000). Die Konjugation von SUMO-1 an zelluläre Faktoren spielt bei vielen zellulären Prozessen eine wichtige Rolle, wie beispielsweise bei nukleozytoplasmatischen Transportvorgängen, Zell-zykluskontrolle, Onkogenese und Abwehr von Virusinfektionen (Saitoh et al., 1997; Hodges et al., 1998; Johnson et al., 1998). Im Wesentlichen scheint die Konjugation von SUMO-1 die Ubiquitinylierung zu verhindern (Desterro et al., 1998), die Protein-Protein-Wechsel-wirkungen zellulärer Komponenten zu beeinflussen sowie die subzelluläre Lokalisation der so

modifizierten Proteine zu verändern (Mahajan et al., 1998; Matunis et al., 1998; Muller et al., 1998).

Abb.C.3: Vergleich der Aminosäuresequenz von verschiedenen zellulären und viralen Proteinen mit der Konsensus-Sequenz des SUMO-1 Konjugationsmotivs ΨΨΨKXE Ψ

Zur Klärung der Fragestellung, ob es sich bei E4^ORF3 um ein virales, Ubiquitin-ähnliches Protein handelt, wurden Mutationsanalysen durchgeführt. Durch die Mutation GG97/98AA wurde das GG-Motiv zerstört, eine gezielte proteolytische Spaltung durch Hydrolasen ver-hindert und dadurch die mögliche Konjugation an anderen Proteinen unterbunden. Die Ein-führung eines Stopp-Kodons im direkten Anschluss an GG-Motiv (GG/Stopp) stellt hingegen ein prozessiertes E4^ORF3-Protein dar, das – ähnlich wie SUMO-1 GG/Stopp – zumindest in vitro wesentlich effizienter an die Zielproteine kovalent gebunden werden sollte. Der Aus-tausch des Lysins (K8R) innerhalb der Ad E4ORF3-Sequenz zerstört zudem das putative Kon-jugationsmotiv am Aminoterminus und verhindert sowohl eine mögliche Modifizierung von E4ORF3 durch Ubiquitin oder anderen Ubiquitin-ähnlichen Proteinen als auch die Kon-jugation mit weiteren E4^ORF3-Molekülen. Zusätzlich inhibiert die Mutation am Lysin⁸, das einzige Lysin in der gesamten Ad5 E4^ORF3-Sequenz, eine weitere mögliche posttranslationale Modifizierung, nämlich die reversible N^ε-Lysin-Azetylierung durch Histonazetyltransferasen (HAT), wie p300/CBP oder P/CAF.

In unserer Arbeitsgruppe lagen bereits einige der zu untersuchenden E4^ORF3-Varianten vor.

Zu ihnen zählen die E4^ORF3-Mutanten K8R, L13A, Y40A, GG97/98AA, GG/Stopp, T96A, L103A und L111A. Zusätzlich wurden während dieser Arbeit die Mutanten NES, EE52/53AA, N82A, L106A sowie L115A hergestellt.