Initiale Expressionsanalyse

Zur experimentellen Überprüfung der Eignung von Haloferax volcanii als Expressionssystem von Genen aus den RSBPs wurden verschiedene Vorexperimente durchgeführt. Das Ziel dieser Experimente war es, ausreichende Mengen an gelöstem Protein zu erzeugen. Folgende Tabelle zeigt einen Überblick der zu diesem Zeitpunkt bekannten Induktionsprotokolle.

Tabelle 58: Induktionsprotokolle für Haloferax volcanii, basierend auf bekannter Literatur sowie Informationen von Dr.

Thorsten Allers. Die OD bezieht sich auf Messungen bei einer Wellenlänge von 650 nm. ET = Expressionstemperatur

ET [˚C]

1. Induktion 2. Induktion Quelle

OD Trp,

Basierend auf vorherigen Publikationen sowie Informationen von Dr. Thorsten Allers, wurde ein 2-stufiges Induktionsprotokoll genutzt. Verschiedene RSBP-Gene wurden hierzu im 100 mL Maßstab in Schüttelkolben bei verschiedenen Temperaturen, sowie verschiedenen Mengen an Induktionsmittel bei verschiedenen Zelldichten exprimiert. Da keine Überexpressionsbanden sichtbar waren, wurden Western-Blots zur Visualisierung der Expressionen genutzt. Der hohe Salzgehalt der Proteinlösung wirkte sich negativ auf den Transfer der Proteine auf die Western-Blot Membran aus, sowie auf die Interaktion mit Antikörpern. Daher wurde das übliche Western-Blot Protokoll um Initiale 3 Waschschritte der SDS-PAGE in ddH2O erweitert.

Es zeigte sich, daß eine Expression bei 45˚C zur erhöhten Aggregationsbildung führte. Daher wurde eine Temperaturverringerung nach der ersten Induktion auf 42˚C durchgeführt. Für Gene aus dem relativ kühlen RSBP Kebrit (26˚C) zeigte eine Temperaturerniedrigung auf 32˚C nach Induktion die besten Ergebnisse.

Des Weiteren zeigte eine erste Induktion bei einer OD650nm von 0,5 mit 3 mM L-Tryptophan sowie eine zweite Induktion nach 15 h Inkubation mit derselben Menge an L-Tryptophan (3 mM), gefolgt von 4 h Inkubation, die beste Proteinausbeute.

Basierend auf diesem Protokoll wurden 6 ausgewählte RSBP-Gene im 100 mL Maßstab in Schüttelkolben exprimiert und die Menge an exprimiertem Genprodukt sowie die Löslichkeit mittels Western-Blot bestimmt.

Abbildung 21: Expressionsanalyse verschiedener RSBP Gene in Haloferax volcanii mittels Western-Blot. A) Überstand des Zelllysats nach Zentrifugation, B) Zellpellet. S = Proteinstandard

Die Western-Blot Analyse zeigte, daß unter den untersuchten Bedingungen eine Expression aller Gene außer HP_D stattfand (Abbildung 21 A und B). Nach Induktion der Haloferax volcanii Zellen mit HP_D fand ein teilweise Lyse der Zellen statt und das Wachstum stagnierte. Die Gene AF_D, DR_A1, DR_D zeigten eine gute Expression in löslicher Form, da Proteinbanden ausschließlich im Überstand (A) und nicht im Zellpellet (B) detektierbar waren. DR_K zeigte einen ähnlichen Trend jedoch bei deutlich geringerer Proteinmenge. Die Temperaturreduktion während der Genexpression zeigte keinen Einfluß auf die Expression von DR_K. PD_A wies eine geringe Expression auf, wahrscheinlich in unlöslicher Form.

5.5.2 Alkoholdehydrogenasen aus Discovery und Atlantis II

Die Alkoholdehydrogenase AF_D wies bereits bei den Voruntersuchungen eine hohe lösliche Expression im Schüttelkoben auf. Die Nutzung desselben Induktionsprotokolls wie in den Voruntersuchungen zeigte eine finale Zelldichte nach der Expression von OD650nm = 2,0 und eine Proteinausbeute im Schüttelkolben von 7,4 mg L^-1 gereinigtem Protein. In Zusammenarbeit mit Eva Strillinger (TUM) konnte die Proteinausbeute auf 109,2 mg L^-1 im Rührkesselreaktor erhöht werden. Weitere Information sind im Folgetext beschrieben.

Die Alkoholdehydrogenase AZ_A wurde auf dieselbe Weise wie AF_D zuerst im Schüttelkolben und später im Rührkesselreaktor exprimiert, jedoch mit geringeren Ausbeuten von 0,9 mg L^-1 im Schüttelkolben und 20,7 mg L^-1 im Rührkesselreaktor. Ebenso waren mehrere Nebenbanden nach der Ionenaustauschchromatographie ersichtlich. Weitere Arbeiten an diesem Enzym führte M. Sc. Anastassja Akal (TUM-KAUST) durch.

Folgender Abschnitt stellt die Expression von AF_D und AZ_A im Rührkesselreaktor als Satzkultivierung dar.

Satzkultivierung von Haloferax volcanii H1895

Zu Beginn dieser Arbeit wurde mit dem Haloferax volcanii Stamm H1424 gearbeitet. Dieser wie ein gutes Wachstum und Genexpression im Rührkesselreaktor auf, erzeugte jedoch starke Biofilmbildung, welche sowohl die Sonden blockierte als auch die Zellernte erschwerte.

Daher wurde der in Zusammenarbeit mit Eva Strillinger (TUM) und Dr. Thorsten Allers (University of Nottingham) entwickelte H1895 Stamm, welcher auf dem H1424 Stamm

basiert und zusätzlich den Knockout der Gene pilB3C3 (Hvo_1033 und Hvo_1034) trug, genutzt.

2 L Rührkesselreaktor

Der Haloferax volcanii H1895 Stamm wurde in einem Parallelrührkesselreaktor-System zur Expression der RSBP-Gene genutzt. Im Folgenden ist eine typische Expression der RSBP Gene am Beispiel der ADHs AF_D und AZ_A dargestellt. Die Zellanzucht erfolgte in Hv-YPC-Medium mit einer ersten Induktion mit 3 mM L-Tryptophan nach 5 h Inkubation und einer zweiten Induktion mit 6 mM L-Tryptophan nach 15 h sowie einer finalen Inkubation von 3 h, bei 45˚C.

Abbildung 22: Anzucht von Haloferax volcanii H1895 im 2 L Rührkesselreaktor in 3 parallelen Ansätzen mit Expression der RSBP Gene AZ_A (2x) und AF_D. Die x-Achse gibt die Zeit nach dem Animpfen an. A) Biotrockenmasse, B) CO2

Gehalt im Abgas, C) O2 Gehalt im Abgas, D) Gelöster Sauerstoff im Medium, E) Titrationsmittelzugabe (negative Werte entspricht der Zugabe von Säure, positive Werte der Zugabe von Base), F) Temperatur im Reaktor mit Peaks, welche die Zugabe der Induktionslösung darstellen

Die Anzucht von Haloferax volcanii im Rührkesselreaktor zeigte generell ähnliche Tendenzen in den ermittelten Parametern für die Duplikate der AZ_A Expression (AZ_A 1 und AZ_A 2), welche Unterschiede zur Expression von AF_D darstellten. So wiesen AZ_A exprimierende Haloferax volcanii Zellen eine höhere Biotrockenmasse als AF_D, bei gleicher Wachstumsrate während der exponentiellen Phase auf (Abbildung 22 A). Der Kohlendioxidgehalt des Abgases nahm bei AZ_A exprimierenden Haloferax volcanii Zellen nach der zweiten Induktion zu und fiel bei den AF_D exprimierenden Haloferax volcanii Zellen ab (Abbildung 22 B). Die Menge an verbrauchtem Sauerstoff reduzierte sich in beiden Fällen nach Erreichen der stationären Phase, jedoch stärker für AF_D exprimierende Haloferax volcanii Zellen (Abbildung 22 C). Die Gelöstsauerstoffkonzentration war auf ≥ 50% eingestellt und wurde (Abbildung 22 D) durch Regelung der Rührerdrehzahl bei konstantem Begasungsvolumen konstant gehalten (Vergleiche hierzu Abbildung 65 B und D im Anhang). Zur Aufrechterhaltung des Sollwertes von pH 7,2 (Vergleiche hierzu Abbildung 65 A im Anhang) wurden zu den AF_D exprimierenden Haloferax volcanii Zellen ausschließlich Base zugegeben, wohingegen die AZ_A exprimierenden Haloferax volcanii Zellen ab einer Inkubationszeit von 14,5 h ihren Metabolismus so änderten, so daß eine Säurezugabe nötig wurde (Abbildung 22 E). Weitere hier nicht dargestellte Satzversuche zeigten, daß im späteren Verlauf (> 24 h Inkubation) auch AF_D exprimierende Haloferax

durch Zugabe des Inokulums und bei den beiden Induktionsschritten auf max. 41˚C ab, blieb im Durchschnitt jedoch bei 44˚C (Abbildung 22 F).

Weitere Prozeßgrößen sind in Abbildung 65 im Anhang dargestellt. Dazu gehören der pH während der Anzucht, die Flußraten der Begasung und - des Abgases sowie die Rührerdrehzahl.

Nach Abschluß der Expression wiesen die AZ_A exprimierenden Haloferax volcanii Zellen eine höhere Zellmasse als die AF_D exprimierenden Zellen auf. Nach der Proteinreinigung hingegen war eine deutlich erhöhte Proteinausbeute von AF_D gegenüber AZ_A ersichtlich.

Folgende Abbildung stellt die SDS-PAGE von AF_D und AZ_A nach Reinigung dar.

Abbildung 23: SDS-PAGE, AF_D und AZ_A exprimiert in Haloferax volcanii im Rührkesselreaktor, nach Reinigung mittels Ni-NTA. S = Standard