Die inhibierte Bindung an CDC48 führt zur vermehrten Selbstubiquitinierung des E4-Enzyms

Die Funktion des E4-Enzyms UFD2 ist eng mit der des CDC48^UFD1/NPL4-Komplexes verknüpft. Dies führt zu der Frage, wie UFD2 auf eine verringerte Bindung an CDC48 bzw. an Substrate reagiert. Tatsächlich ist das E4-Enzym in ufd1-2-Mutanten im Vergleich zu Wildtyphefen verstärkt modifiziert (Abb. 2-18a). Dies konnte auch in später beschriebenen Sukrosegradienten zur Analyse der Membranassoziation von UFD2 in ufd1-2-Mutanten beobachtet werden (Abb. 2-20). Die durch gestörte Substrat- oder CDC48-Erkennung verstärkte Modifikation wird bei UFD2^∆UBOX weder in WT-Zellen noch in Mutanten des CDC48^UFD1/NPL4-Komplexes detektiert (Abb. 2-18a). Im Falle der RING-Finger-Proteine wurde Autoubiquitinierung beschrieben, die in vitro bereits für die RING-Finger-homologe U-Box-Domäne nachgewiesen wurde (Fang et al., 2000; Yang et al., 2000; Ryoo et al., 2002; Abb. 2-14). Es wurde daher untersucht, ob die reguliert auftretende, U-Box-abhängige Modifikation des E4-Enzyms Ubiquitinierung darstellt.

Um dies zu analysieren, wurde ^HisUbiquitin in Hefezellen überexprimiert. Mit

HisUbiquitin konjugierte Proteine wurden denaturierend durch Bindung an magnetische NiNTA-Perlen gereinigt und im anti-myc-Immunoblot auf UFD2^myc bzw.

UFD2^∆UBOX/myc hin analysiert (Abb. 2-18b). Dies zeigte, daß UFD2, nicht aber UFD2^∆UBOX, in ubiquitinierter Form vorliegt (Abb. 2-18b). Die durch Inaktivierung des CDC48^UFD1/NPL4-Komplexes vermehrt auftretende Modifikation ist daher eine U-Box-abhängige Ubiquitinierung des E4-Enzyms.

Autoubiquitinierung kann ein Protein dem proteasomalen Abbau zuführen, wie dies für die RING-Finger-Proteine IAP („Inhibitor of Apoptosis“) und Mdm2 beschrieben wurde (Fang et al., 2000; Yang et al., 2000). Es wurde deshalb die Stabilität von UFD2^myc in Pulse-Chase-Experimenten untersucht. UFD2^myc ist sowohl in Wildtyphefen als auch in ufd1-2-, cdc48-6- und ufd1-2 cdc48-6-Mutanten ein stabiles Protein mit einer Halbwertszeit von mehr als zwei Stunden (Abb. 2-18c). In WT-Hefezellen wird jedoch ein N-terminales Abbauprodukt des E4-Enzyms beobachtet, welches in den Mutanten des CDC48^UFD1/NPL4-Komplexes vermindert auftritt. Dieses Abbauprodukt kann in UFD2^∆UBOX-Mutanten nicht nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Untersuchung eines diesem Abbauprodukt entsprechenden UFD2^∆N-Konstruktes im Zwei-Hybrid-System zeigt, daß es nicht mit CDC48 wechselwirken kann (Abb 2-18d). Da es in Mutanten des CDC48^UFD1/NPL4 -Komplexes vermindert auftritt, spiegelt das Abbauprodukt vermutlich einen CDC48-abhängigen Inaktivierungsprozess des E4-Enzyms wider. Die verstärkte Ubiquitinierung von UFD2 in Mutanten des CDC48^UFD1/NPL4-Komplexes bewirkt hingegen nicht den proteasomalen Abbau eines signifikanten Anteils des Proteins.

Interessanterweise wurde in ähnlichen Experimenten auch Ubiquitinierung von CDC48 detektiert. Ubiquitinierte Formen der Segregase treten nach Überexpression N-terminal myc-markierten Ubiquitins auf, das von Ubiquitin-Hydrolasen nicht effizient erkannt wird (Abb. 2-18e; Ellison und Hochstrasser, 1991). Die Ubiquitinierung von CDC48 ist abhängig von UFD2, da konjugiertes CDC48 in Mutanten des E4-Enzyms nicht beobachtet wird. Vergleichbar mit der Autoubiquitinierung des E4-Enzyms führt die Ubiquitinierung der Segregase nicht zu deren proteasomalem Abbau, da CDC48 sowohl in WT- als auch in ufd2-Zellen in Pulse-Chase-Experimenten stabil ist (Abb. 2-18f). Auch das U-Box-abhängige E4-Enzym CHIP interagiert mit einem Chaperon, Hsp70/Hsc70, und vermittelt dessen Ubiquitinierung (Jiang et al., 2001; Imai et al., 2002). Analog zu UFD2 scheint dies die Ubiquitinierung und den Abbau der Chaperon-gebundenen Substrate zu fördern (Connell et al., 2001). Das Chaperon selbst bleibt, wie CDC48, stabil.

Welche Bedeutung besitzen die beobachteten Ubiquitinierungsreaktionen?

UFD2-Autoubiquitinierung tritt unter Bedingungen auf, unter denen die Wechselwirkung des E4-Enzyms mit CDC48 bzw. mit Substraten inhibiert ist. Die UFD2-abhängige CDC48-Ubiquitinierung wird dagegen in allen bisher untersuchten Mutanten detektiert. Beide Reaktionen können Nebenreaktionen der in vivo bedeutsamen Multiubiquitinierung CDC48-gebundener Substrate darstellen. Sie könnten aber auch die Grundlage eines Regulationsmechanismus sein, der als Sensor der Substratbeladung der Segregase wirkt und eventuell vorhandene, unproduktive CDC48/UFD2-Komplexe destabilisiert.

Rekrutierung des E4-Enzyms UFD2 durch CDC48

Abbildung 2-18: Die Autoubiquitinierung von UFD2 tritt bei inhibierter Substrat- bzw. CDC48-Erkennung vermehrt auf. a. UFD2 zeigt verstärkt modifizierte Formen in ufd1-2-Mutanten.

Chromosomal myc-Epitop markiertes UFD2 bzw. UFD2^∆UBOX wurden in WT- bzw. in ufd1-2-Hefezellen exprimiert und im anti-myc-Immunoblot analysiert. b. UFD2, aber nicht UFD2^∆UBOX, ist ubiquitiniert.

Nach Expression von ^HisUbiquitin wurden Ubiquitinkonjugate denaturierend durch Bindung an NiNTA-Perlen gereinigt und auf myc-Epitop-markiertes UFD2 bzw. UFD2^∆UBOX im anti-myc-Immunoblot untersucht. c. UFD2 ist ein stabiles Protein. Die Stabilität von UFD2^myc wurde in verschiedenen Mutanten im Pulse-Chase-Experiment untersucht. Zu den angegebenen Zeitpunkten nach Zugabe nicht-radioaktiven Methionins wurde UFD2 aus Zellysaten durch anti-myc-Antikörper gefällt. Die Immunpräzipitate wurden im Autoradiogramm analysiert. Der Stern kennzeichnet ein N-terminales Abbauprodukt von UFD2, das in Mutanten des CDC48^UFD1/NPL4-Komplexes noch bei UFD2^∆UBOX in geringerer Menge detektiert wird. d. N-terminal verkürztes UFD2 interagiert nicht mit CDC48. Ein dem in (c) beobachteten Abbauprodukt entsprechendes UFD2-Konstrukt (UFD2^∆N150) wurde in Vektoren des Zwei-Hybrid-Systems kloniert und neben UFD2 und UFD2^∆UBOX auf eine Wechselwirkung mit CDC48 getestet. Als Kontrolle wurde leerer pGAD-Vektor eingesetzt. e. CDC48 ist nach Expression von ^mycUbiquitin vermehrt ubiquitiniert. Die Ubiquitinierung hängt zudem von UFD2 ab. ^VSVCDC48 wurde mit oder ohne ^mycUbiquitin in den entsprechenden Mutanten exprimiert und im anti-VSV-Immunoblot analysiert. e. CDC48 ist ein stabiles Protein. Die Stabilität von CDC48 wurde analog zu (c) in WT- und ufd2-Hefezellen im Pulse-Chase-Experiment analysiert. Die anti-CDC48-Immunpräzipitate wurden im Autoradiogramm analysiert.