Infektion mit dem intrazellulären Bakterium Listeria monocytogenes

Die Infektion von Mäusen mit L. monocytogenes ist eines der am besten charakterisierten Infektionsmodelle für intrazelluläre, bakterielle Krankheitserreger. In den letzten Jahren konnten die immundominanten Epitope verschiedener Listerien-Proteine charakterisiert werden, die im Verlauf einer L. monocytogenes-Infektion von CD8⁺ T-Zellen erkannt werden.

Lösliche MHC-Klasse-I/Peptid-Komplexe (MHC-Klasse-I-Tetramere) ermöglichen die quantitative Charakterisierung der spezifischen CD8⁺ T-Lymphozyten-Antwort (s. 1.5.2). Die TIM-3 Expression von CD4⁺ Th- und CD8⁺ T-Zellen nach einer intravenösen Primärinfektion (Abb. 4.4) und nach einer oralen Sekundärinfektion (Abb. 4.5) mit L. monocytogenes wurde in BALB/c Mäusen untersucht. Mit Hilfe von löslichen MHC-Klasse-I/LLO_91-99 Peptid-Komplexen (MHC-Klasse-I-Tetramere) konnte die für ein immundominantes listerielles Antigen spezifische CD8⁺ T-Zell-Antwort quantitativ verfolgt werden (s. 1.5.2). Für die Primärinfektion wurden BALB/c Mäuse intravenös mit 2,6 x 10⁺³ L. monocytogenes, Stamm EGD Serovar 1/2a infiziert und 9, 13 oder 21 Tage später untersucht. Für die Sekundärinfektion wurden BALB/c Mäuse zunächst intravenös mit 2x10⁺³ L. monocytogenes infiziert und 11 bis 12 Wochen später oral mittels Gavage mit 2x10⁺⁹ L. monocytogenes infiziert und 3, 7 und 10 Tage danach untersucht. Hierfür wurden Lymphozyten aus den angegebenen Organen von infizierten Mäusen und nichtinfizierten Kontrollen isoliert, mit Fluorochrom konjugierten Antikörpern und MHC-Klasse-I/LLO91-99 Tetramerkonstrukten markiert und am Durchflusszytometer analysiert. Tote Zellen wurden durch Anfärbung mit PI ausgeschlossen. In Abb. 4.4 sind die nach der Primärinfektion erhaltenen Ergebnisse zusammengefasst.

Der Anteil TIM-3 exprimierender Zellen ist 9 Tage nach einer intravenösen Primärinfektion mit L. monocytogenes in der Milz auf den CD8⁺ T-Lymphozyten leicht, um das zwei- bis vierfache, im Vergleich zu den nichtinfizierten Kontrollen erhöht und liegt bei ca. 4,5% der CD8⁺ T-Zellen (Abb.4.4 B). Von Tag 9 bis Tag 13 sinkt die Frequenz wieder auf das Niveau der Kontrollen. Der Anteil der gegen das immundominante Epitop LLO_91-99 spezifischen Zellen an der Gesamtpopulation der CD8⁺ T-Zellen liegt 9 Tage nach der Infektion bei 3 bis 3,5% und nimmt danach ebenfalls ab (Abb.4.4 C). Die TIM-3 Expression auf CD8⁺ T-Zellen der Milz hat somit einen ähnlichen Verlauf wie die gegen das immundominante Epitop des LLO gerichtete spezifische Antwort der CD8⁺ T-Zellen nach einer intravenösen Primärinfektion mit L. monocytogenes. Die Expression von TIM-3 auf den Th-Zellen in der Milz ist nach systemischer Infektion fast unverändert (Abb. 4.4 A). Der Anteil TIM-3⁺ Zellen liegt am Tag 9 zwischen 1 und 1,5% der CD4⁺ Th-Zellen und ist somit etwas höher als bei nichtinfizierten Tieren. Dieser Unterschied liegt jedoch nur knapp außerhalb des Variabilitätsbereichs der Standardabweichungen. 13 und 21 Tage nach Infektion liegt der Anteil wieder auf dem Niveau von nichtinfizierten Tieren. Somit hat die intravenöse

Primärinfektion mit L. monocytogenes keinen ermittelbaren Einfluss auf die Expression des TIM-3 Moleküls auf Th-Zellen in der Milz.

nichtinfiziert Tag 9 Tag 13 Tag 21 0.0

CD8-nichtinfiziert Tag 9 Tag 13 Tag 21 0.0

nichtinfiziert Tag 9 Tag 13 Tag 21 0.0

Abb. 4.4: Kinetik der TIM-3 Expression auf T-Zellen nach Frequenz TIM-3⁺ Zellen der CD4⁺ CD8^- Th-Zellen (A) bzw.

der CD4^- CD8⁺ T-Zellen (B). Mit Hilfe von H2-K^d-LLO91-99

Tetramerkonstrukten wurde der Anteil der für ein listerielles immundominantes Epitop spe-zifischen CD8⁺ T-Zellen durch-flusszytometrisch untersucht (C). Gezeigt ist bis auf Tag 21 der Mittelwert mit Standardab-weichung von jeweils 3 bis 4 Tieren pro Zeitpunkt.

Im Folgenden wurde die Expression von TIM-3 auf T-Zellen nach einer oralen Sekundärinfektion mit L. monocytogenes in Mäusen untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse

sind in Abb. 4.5 dargestellt.

Abb. 4.5: Kinetik der TIM-3 Expression auf T-Zellen nach aus der Milz, der Leber und dem Dünndarm (DD-IEL und DD-LPL) isoliert und durchflusszytometrisch der Anteil TIM-3 exprimierender Zellen der CD3⁺/CD4⁺ T-Helfer-Zellen (A) und der CD8⁺ T-Zellen (B) bestimmt. Mit Hilfe von H2-K^d -LLO91-99 Tetramerkonstrukten wur-de wur-der Anteil wur-der für ein listerielles immundominantes Epitop spezifi-schen CD8⁺ T-Zellen durchfluss-zytometrisch untersucht (C).

Gezeigt ist der Mittelwert mit Standardabweichung von jeweils 3 Tieren pro Zeitpunkt (n.u.: nicht untersucht).

Nach einer oralen Sekundärinfektion mit L. monocytogenes sinkt der Anteil TIM-3 exprimierender Zellen unter den CD3⁺ CD4⁺ Th-Zellen in der Dünndarm-IEL-Fraktion von 7,5% bei nichtinfizierten Tieren auf ca. 2,5% drei bis zehn Tage nach der Infektion und in der Dünndarm-LPL-Fraktion von 3,5% auf ca. 1,5% (Abb. 4.5 A). In Milz und Leber bleibt er unverändert. Bei den CD3⁺ CD8⁺ T-Zellen erhöht sich der Anteil bei den DD-LPL nach 3 Tagen leicht von ca. 1% auf ca. 2,7%, nach sieben Tagen liegt er wieder im Bereich der naiven Kontrollen (Abb. 4.5 B). Der Anteil LLO91-99 spezifischer CD8⁺ T-Zellen steigt nach Sekundärinfektion in Milz, Leber und DD-LPL an, womit sichergestellt wurde, dass die untersuchten Tiere infiziert waren (Abb. 4.5 C).

Somit erhöht sich nach einer primären intravenösen Infektion mit dem intrazellulären Bakterium L. monocytogenes der Anteil TIM-3⁺ Zellen unter den CD8⁺ T-Zellen der Milz geringfügig um das zwei- bis vierfache, unter den CD4⁺ Th-Zellen ist er kaum verändert.

Nach einer oralen Sekundärinfektion bleiben die Frequenzen TIM-3⁺ Zellen unter den CD4⁺ Th-Zellen und den CD8⁺ T-Zellen in Milz und Leber unverändert. In der Lamina Propria des Dünndarms ist 3 Tage nach der Sekundärinfektion der Anteil TIM-3⁺ der CD8⁺ T-Zellen geringfügig höher als bei nichtinfizierten Tieren. Die Infektion von Mäusen mit dem fakultativ intrazellulären Bakterium L. monocytogenes verändert die Frequenz der TIM-3 exprimierenden Th- und CD8⁺ T-Zellen nur wenig oder gar nicht. Sowohl bei einer primären als auch bei einer sekundären Gedächtnis-Immunantwort liegen die beobachteten Unterschiede in Bereichen unter 5% der jeweils betrachteten Gesamtpopulation.