Expression von TIM-3 auf verschiedenen Zellpopulationen

Zunächst sollte die Expression auf Proteinebene von TIM-3 auf verschiedenen Zellpopulationen des Immunsystems untersucht werden. Lymphozyten wurden aus der Milz gesunder, unter SPF-Bedingungen gehaltener BALB/c Mäuse isoliert und durchflusszytometrisch auf die Expression von TIM-3 analysiert. Es wurden drei verschiedene T-Zell-Populationen (Abb. 4.1) und drei verschiedene Populationen APZ (Abb.

4.2) untersucht. Wie in Abb.4.1 für T-Zellen und in Abb.4.2 für APZ beispielhaft gezeigt, wurde bei der Analyse nach der Exklusion toter Zellen durch Anfärbung mit PI zunächst die gewünschte Population ausgewählt, die in den Abb. 4.1 und 4.2 jeweils rot hervorgehoben wurde (s. 3.4.1). Dabei handelte es sich bei den T-Zellen um CD3⁺ CD4⁺ Th-Zellen, CD3⁺ CD8⁺ ZTL und CD3⁺ γ/δ-TZR⁺ T-Zellen (γ/δ-T-Zellen) und bei den APZ um MHCII⁺ CD19⁺ B-Zellen, CD11c⁺ CD11blo (von engl. : low, niedrig) dendritische Zellen und CD11c^- CD11bhi (von engl.: high, hoch) Makrophagen.

R4 R5 R6

CD3

CD4 CD8 γ/δ TZR

γ/δ TZR

CD4 CD8

TIM-3 TIM-3 blockiert

0,6 1,0 8,8

2,8 0,2

0,2

Abb. 4.1: TIM-3 Expression auf T-Zellen. Aus gesunden, unter SPF-Bedingungen gehaltenen BALB/c Mäusen isolierte Splenozyten wurden mit Fluorochrom konjugierten mAk für die Oberflächenexpression von CD3, CD4, CD8, γ/δ-TZR und TIM-3 markiert und durchflusszytometrisch untersucht. In den Dot Plots der oberen Reihe sind lebende Lymphozyten nach PI-Exklusion dargestellt. Auf der x-Achse ist die CD3 Expression und auf der y-Achse die Expression von CD4, bzw. CD8 oder γ/δ-TZR dargestellt. Die in der Spalte darunter ausgewählte Zellpopulation ist jeweils rot hervorgehoben. In der mittleren Reihe wird auf der y-Achse die TIM-3 Expression angezeigt. Als Gegenparameter ist auf der x-Achse CD4 für die ausgewählten CD3⁺ CD4⁺ T-Helfer-Zellen, bzw.

CD8 für die CD3⁺ CD8⁺ T-Zellen, bzw. γ/δ-TZR für die ausgewählten CD3⁺ γ/δ-TZR⁺ γ/δ-T-Zellen aufgetragen. In der unteren Reihe wird jeweils die Spezifitätskontrolle für den darüber liegenden Dot Plot gezeigt, bei der die Markierung TIM-3 exprimierender Zellen mit einem 50 bis 100fachen Überschuss an unkonjugiertem anti-TIM-3 blockiert wurde. Im oberen rechten Quadranten ist jeweils der Anteil koexprimierender Zellen an der ausgewählten Population in Prozent angegeben. Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis von 4 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.

R7 R8 R9

CD19 CD11c CD11b

MHCII CD11c

TIM-3 TIM-3 blockiert

1,8 97,1 6,6

0,6 0,4 2,0

CD11c

CD19 CD11b CD11b

Abb. 4.2: TIM-3 Expression auf APZ. Aus gesunden, unter SPF-Bedingungen gehaltenen BALB/c Mäusen isolierte Splenozyten wurden mit Fluorochrom konjugierten mAk für die Oberflächenexpression von MHCII, CD19, CD11b, CD11c und TIM-3 markiert und durchflusszytometrisch untersucht. In den Dot Plots der oberen Reihe sind lebende Lymphozyten nach PI-Exklusion dargestellt. Die in der Spalte darunter ausgewählte Zellpopulation ist jeweils rot hervorgehoben. In der mittleren Reihe wird auf der y-Achse die TIM-3 Expression angezeigt. Als Gegenparameter ist auf der x-Achse CD19 für die ausgewählten MHCII⁺ CD19⁺ B-Zellen, bzw. CD11c für die CD11b^lo CD11c⁺ dendritischen Zellen, bzw. CD11b für die ausgewählten CD11b^hi CD11c^- Makrophagen aufgetragen. In der unteren Reihe wird jeweils die Spezifitätskontrolle für den darüber liegenden Dot Plot gezeigt, bei der die Markierung TIM-3 exprimierender Zellen mit einem 50 bis 100fachen Überschuss unkonjugierten anti-TIM-3 blockiert wurde. Im oberen rechten Quadranten ist jeweils der Anteil koexprimierender Zellen an der ausgewählten Population in Prozent angegeben. Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis von 4 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.

Auf allen untersuchten T-Zellpopulationen konnte die Expression von TIM-3 nachgewiesen werden. Der ermittelte Anteil markierter TIM-3⁺ Zellen ist zwar sehr niedrig, lässt sich jedoch, wie in Abb. 4.1 gezeigt, spezifisch mit einem 50 bis 100fachen Überschuss an unkonjugiertem anti-TIM-3 Antikörper blockieren. Die spezifische Blockierung war ebenso

effektiv, wenn der Fluorochrom konjugierte anti-TIM-3 Antikörper vor der Zellmarkierung mit TIM-3 Fusionsprotein inkubiert wurde (Daten nicht gezeigt).

Abb. 4.2 zeigt, dass zwar ein Teil der MHCII⁺ CD19⁺ B-Zellen mit anti-TIM-3 markiert werden kann, diese Markierung wird jedoch nicht durch vorheriges Blockieren mit unkonjugiertem anti-TIM-3 beeinträchtigt und ist deshalb unspezifisch. B-Zellen in der Milz gesunder, unter SPF-Bedingungen gehaltener BALB/c Mäuse exprimieren somit kein mit der verwendeten Methode detektierbares TIM-3 auf ihrer Oberfläche. Die TIM-3 Markierung der CD11c⁺ CD11b^lo dendritischen Zellen sowie der CD11c^- CD11b^hi Makrophagen ist dagegen spezifisch und kann durch unkonjugierten anti-TIM-3 Antikörper blockiert werden. Abb. 4.2 zeigt, dass Zellen, die TIM-3⁺ CD11c⁺ sind, diagonal im oberen Quadranten liegen. Wie an der blockierten Kontrolle gezeigt wird, liegt dieser Effekt nicht an einer fehlerhaften Kompensation der Einstellungen am Durchflusszytometer. CD11c⁺ CD11b^lo dendritische Zellen, die CD11c stark exprimieren, haben auch am meisten TIM-3 auf ihrer Oberfläche.

In Tab. 4.1 werden die in verschiedenen Versuchen erhaltenen Daten zusammengefasst.

Dabei wurde jeweils der Hintergrund der jeweiligen Spezifitätskontrolle vom Wert für den prozentualen Anteil TIM-3⁺ Zellen abgezogen. Die so erhaltenene spezifische Expression ist in Tab. 4.1 als Mittelwert mit Standardabweichung angegeben.

Th-Zellen

Tab. 4.1: TIM-3 Expression auf Splenozyten. In dieser Tabelle werden die in 4 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen ermittelten Daten zusammengefasst. Angegeben ist jeweils der Anteil TIM-3 exprimierender Zellen in der Milz gesunder, unter SPF-Bedingungen gehaltener BALB/c Mäuse in Prozent der angegebenen Population abzüglich der Spezifitätskontrolle als Mittelwert +/- Standardabweichung. In Klammern ist die Anzahl der untersuchten Proben angegeben.

Die für γ/δ-T-Zellen und Makrophagen erhaltenen relativ hohen Standardabweichungen könnten an einer biologischen Variabilität liegen. Es fällt jedoch auf, dass diese beiden Populationen im Verhältnis zu den anderen untersuchten Zellarten schlechter abgegrenzt sind. Vermutlich führt die daraus resultierende höhere Ungenauigkeit bei der Auswahl dieser Populationen zu den höheren Standardabweichungen.

In der Milz gesunder, unter SPF-Bedingungen gehaltenerBALB/c Mäuse liegt der Anteil TIM-3 exprimierender Zellen bei den Th-Zellen und den CD8⁺ T-Zellen jeweils unter 1%. Ein etwas höherer Anteil der Makrophagen und der γ/δ-T-Zellen exprimiert TIM-3. Auf der

Zelloberfläche von B-Zellen wurde keine detektierbare Expression von TIM-3 gemessen. Die meisten (>75%) dendritischen Zellen in der Milz gesunder SPF-Mäuse exprimieren TIM-3.

Somit sind neben CD4⁺ T-Helfer-Zellen auch CD8⁺ T-Zellen und γ/δ-T-Zellen in der Lage, TIM-3 auf ihrer Zelloberfläche zu exprimieren. Die Expression von TIM-3 ist jedoch nicht auf T-Zellen beschränkt. Darüber hinaus wird TIM-3 auch von professionellen APZ, und zwar von einem Teil der Makrophagen und der Mehrheit der dendritischen Zellen, in der Milz exprimiert. TIM-3 wird somit nicht spezifisch nur von einer bestimmten T-Zellpopulation exprimiert, sondern kann auch von anderen T-Zellpopulationen und einem Teil der APZ des Immunsystems gebildet werden.

Da TIM-3 bei der Suche nach differenziell von Th1- und Th2-Zellen exprimierten Genen gefunden wurde, wurde bei den folgenden Analysen der Schwerpunkt auf die Untersuchung der TIM-3 Expression auf T-Zellen, insbesondere auf T-Helfer-Zellen gelegt.

4.1.2 TIM-3 Expression auf T-Zellen in verschiedenen Organen und unterschiedlichen