Individualisierung und Authentifizierung

Alle Individuen der Stichproben aus den Skelettserien L¨ubeck wurden mit der Oktaplex-PCR zur Bestimmung des genetischen Fingerabdrucks typisiert. Ver-gleichsdaten lagen f¨ur die Individuen des Fundkomplex Lichtensteinh¨ohle bereits

9.5 Genetischer Fingerabdruck 97

vor (Schultes, 2000; Schilz, 2006) (vgl. Tab.12, S.226). Aufgrund des großen Pro-benumfangs konnte die doppelte Reproduktion der Ergebnisse im gegebenen Zeit-rahmen nicht erreicht werden. F¨ur zuk¨unftige Studien sollten daher die Ergeb-nisse vervollst¨andigt werden. F¨ur den Ausschluß von Kontaminationen und die Individualisierung der SNP-Typisierungen ist die Datenlage jedoch ausreichend.

Bei Proben mit guter DNA-Erhaltung wurde mindestens je eine PCR aus zwei Extrakten angefertigt. Bei unvollst¨andigen Ergebnissen wurden weitere Amplifi-kationen mit ver¨andertem Extrakt-Einsatz durchgef¨uhrt. Blieb die Amplifikati-on nach zwei AmplifikatiAmplifikati-onen erfolglos, wurde auf weitere Versuche verzichtet.

Aus den angefertigten Extrakten konnte f¨ur 32,6 % der Individuen der Serie”HL Hungersnot“ und 32,9 % der Serie ”HL Pest“ ein kompletter genetischer Fin-gerabdruck erstellt werden. Alle acht Systeme wurden erfolgreich typisiert. F¨ur weitere 20,7 % waren die Ergebnisse nahezu vollst¨andig, einzelne Allele bzw. Sy-steme wurden nicht reproduziert. Bei 16,3 % (

”HL Hungersnot“) und 6,1 % (

”HL Pest“) waren die Amplifikationen erfolglos. F¨ur die ¨ubrigen Individuen blieben die Ergebnisse unvollst¨andig. Der Amplifikationserfolg war insgesamt besser f¨ur die Individuen der Serie”HL Hungersnot“. Der geringere Anteil an fehlenden Er-gebnissen ist auf die Tatsache zur¨uckzuf¨uhren, daß bei den Individuen der Serie

”HL Pest“ zun¨achst mehrere Amplifikationsversuche auch bei geringem Ampli-fikationserfolg durchgef¨uhrt wurden. Die erfolgreich typisierten zwei bis vier Sy-steme stammen dabei h¨aufig aus verschiedenen Amplifikationen. Eine genauere Aufschl¨usselung des Amplifikationserfolges geht aus Tabelle 34 hervor.

Tab. 34: Amplifikationserfolg der STR-Genotypisierung zur Erstellung des genetischen Fingerab-drucks. Dargestellt wird der Anteil der Proben in denen 0 bis 1, 2 bis 4, 5 bis 7, 7 bis 8 oder alle acht Systeme mit mindestens einem sicheren Allel typisiert werden konnten. In die Kategorie 7-8 fallen die Proben, die mindestens in sieben Systemen sichere sowie weitere unsichere Allele zeigen.

Serie 0-1 2-4 5-7 7-8 8

HL Hungersnot 16,3 % 2,3 % 25,6 % 20,7 % 32,6 % HL Pest 6,1 % 14,6 % 25,6 % 20,7 % 32,9 %

Als Beispiel der Analyse der coamplifizierten STR zeigt Abb. 31 das Elektrophe-rogramm der STR-Fragmente der Probe HL1976, die in der in Abb. 10 gezeigten PCR (Multiplex B) amplifiziert wurde. Beide STR-Systeme konnten erfolgreich farbmarkiert und analysiert werden. Die Allele treten durch deutliche peaks in

9.5 Genetischer Fingerabdruck 98

Erscheinung. Eine Verst¨arkung des Ph¨anomens der stutter-alleles gegen¨uber der herk¨ommlichen STR-Multiplex-PCR konnte trotz der zweiten PCR mit nur 5 Zyklen nicht beobachtet werden.

Abb. 31:HL1976: Elektropherogramm zur STR-Analyse. Beide amplifizierte Systeme treten durch deutlichepeaks in Erscheinung. In orange ist eine Allelleiter f¨ur die Loci hinterlegt.

Die STR-Systeme D13S317 und FGA wurden f¨ur die Authentifizierung der SNP-Daten verwendet. Der Amplifikationserfolg des STR D13S317 war geringf¨ugig h¨oher, wie es seine geringere Fragmentl¨ange erwarten l¨aßt. In sieben Proben der Serie

”HL Hungersnot“ fiel das System D13S317 jedoch komplett aus, dies war f¨ur acht Proben im System FGA der Fall. In sechs Proben waren beide Systeme gleichzeitig betroffen. F¨ur die ¨ubrigen 20,9 % (”HL Hungersnot“) bzw. 30,5 % (”HL Pest“) konnten beide Systeme erfolgreich bestimmt werden.

Die Tabellen 36 und 37 geben eine ¨Ubersicht der erstellten genetischen Fingerab-dr¨ucke. Die Ergebnisse der Einzeltypisierungen werden im Anhang in den Tabel-len 49 und 48 vorgestellt.

Die genetischen Fingerabdr¨ucke sind die Grundlage zur Bewertung der Authenti-zit¨at der SNP-Typisierungen. Die ¨Ubereinstimmung der mit den SNP koamplifi-zierten STR D13S317 und FGA mit den genetischen Fingerabdr¨ucken lassen die Bewertung der Authentizit¨at zu sowie der ¨Uberpr¨ufung der korrekten Zuordnung der Einzeltypisierungen zu den beprobten Individuen. In einem Fall (HL1999/2 Extrakt 1, Tab. 35) zeigte der typisierte Fingerabdruck in einer Oktaplex-PCR Ubereinstimmung mit dem eines Bearbeiters. Weitere Amplifikationen und die¨ SNP-Multiplex dieses Extraktes zeigten jedoch die ¨Ubereinstimmung der STR mit dem Fingerabdruck des historischen Individuums. Als Ursache der Abweichung kommt damit nur die einmalige Kontamination des Oktaplex-PCR-Ansatzes in

9.5 Genetischer Fingerabdruck 99

Frage, bei der die Speichelprobe des Bearbeiters als Positivkontrolle verwendet wurde. Der Extrakt wurde daher nicht aus der Untersuchung ausgeschlossen.

Tab. 35: HL 1999/2: Einzelamplifikationen der Oktaplex-PCR als Beispiel einer aufgedeckten Kon-tamination des PCR-Ansatzes in der ersten PCR.

Extrakt PCR D13 CSF FGA Amelo- VWA D5 D3 D21

S317 1PO genin S818 S1358 S11

PK 11/12 11/12 20/22.2 X/- 14/18 10/11 14/15 28/32.2

Ez1 Z37 1 11/12 11/12 20/22.2 X/- 14/18 10/11 14/15 28/32.2

Ez1 Z37 2 8/11 (11)/- -/- X/Y 16/18 11/13 18/-

-/-Ez3 Z37 3 8/11 -/- -/- X/Y 16/18 11/13 18/-

-/-Ez1 Z36 4 8/11 11/12 22/27 X/Y 15/16/18 11/13 (17)/18

29/-Die Extrakte der Proben HL1999/1 und HL1999/2 aus der zweiten Extrakti-onsserie (Ez2) wurden vertauscht, konnten jedoch mangels Vollst¨andigkeit der Fingerabdr¨ucke nicht eindeutig zugeordnet werden. Die STR-Systeme D13S818 und FGA konnten zwar wiederholt amplifiziert werden. Die Individuen tragen zu

¨ahnliche Allele, um die Extrakte alleine nach diesen Systemen sicher zuzuord-nen. Sie wurden aus der Untersuchung ausgeschlossen und neue Extrakte (Ez3) angefertigt.

9.5 Genetischer Fingerabdruck 100

Tab.36:GenetischeFingerabdr¨uckederIndividuenausderSkelettserieL¨ubeckPest.FNR:Fundnummer;Amelo:Amelogenin,Geschlechtsmarker;-/-:System ausgefallen;():unsicheresAllel,/-:keinzweitesAllelbeobachtet. FNRD13CSFFGAAmelo-VWAD5D3D21 FNRS3171POgeninS818S1358S11 HL089110/1110/1021/-X/-(17/18)11/1217/1829/30 HL0927(8/15)(22)/--/--/--/-(13/14)(14/15)-/- HL093412/-(11/12)-/-X/-(18)/-(8/11)-/--/- HL094212/-(10/12)21/-X/-18/-11/-14/-(31.2)/- HL0945/1-/--/--/--/--/--/--/-(31)/- HL095812/-11/1119/21X/X(15)/2011/13(15)/17(31.2)/- HL09659/1210/-24/-X/-(17)/-10/11(16)/18(28)/- HL097212/--/-(21)/-X/-(16)/-8/(11)-/-(31.2)/- HL0994/18/(11)(10/11/12)20/(25)X/-(16)/-12/-16/-(29/30.2) HL1006(12)/-(13)/-(21/21.2)X/Y(15/17)(11/13)(15/18)(28/30.2) HL1037(13)/--/--/--/--/--/-(15/16)(31.2)/- HL1043-/--/--/--X/--/-(13/15)-/-(29)/- HL1047-/--/--/--/-14/-8/-(16)/--/- HL10818/11-/--/-X/--/--/-17/-29/(31) HL1102-/--/--/-X/--/-(13)/--/-(30.2)/- HL1106-/-(13)/--/--/--/--/--/--/- HL11128/-(9/11)-/-X/-14/1911/(11)-/-(29)/30 HL113312/(14)(11)/-(22/24/25)X/(Y)(15/18)10/12(16/17)(34.2)/- HL11548/12(10/12)(23)/-X/Y15/(19)13/-(14)/1531/(31) HL1156-/--/-20/(21/22)X/(Y)(16/18)(10/13)-/-(33)/- HL1188-/--/--/--/--/-(13)/--/-(27.2)/- HL1217-/--/--/--/--/--/--/--/-

HL1217-/--/--/--/--/--/--/--/-9.5 Genetischer Fingerabdruck 101

Tab.36:Fingerabdr¨uckedesSkelettkollektivsL¨ubeckPestfortgesetzt FNRD13CSFFGAAmelo-VWAD5D3D21 FNRS3171POgeninS818S1358S11 HL12199/1110/(11)19/(22)X/Y17/1911/1214/1529/33 HL122511/(11)11/12(24/25)X/X16/1911/1216/1730/- HL122712/--/-25/-X/Y16/1811/(12)(15/16)(32.2)/- HL123212/-10/(12)22/(26)X/Y17/(17)11/-15/1629/30.2 HL1234-/-(12)/-(19/22)X/(Y)15/(17)11/(12)(16)/-27/29 HL1262-/--/--/-(X)/--/-(8)/-(16)/--/- HL12708/-(11)/-(20/22)X/-(15/17)(13)/-(15)/--/- HL1271(11)/-(10/11)-/-X/Y(18)/-10/11(16)/--/- HL1273(9/13)-/--/--/--/-12/(14)-/-28/32.2 HL12929/1311/1221/-X/Y14/(16)11/(12)15/16(27/32.2) HL1331-/--/--/--/--/--/--/--/- HL1341(8/11)10/-(24/25)X/-(18)/-(11/13)-/-(34.2)/- HL134310/12(10/12)(20/21/23)X/X16/(17)12/13(18)/-(31/32.2) HL135511/1111/1221/23X/X15/1612/1315/1728/29 HL13579/13(10)/1222/-X/X14/1811/1214/1728/(28) HL1359(8)/-(10/12/13)24/--/-(12/16)(13)/-(15)/-(27/31) HL136111/14(10)/--/-X/Y(17/18)-/-(15/18)(28/29/31.2) HL138311/1210/(10)(21)/25X/X16/1810/1116/(16)28/(31) HL1396-/--/--/-X/--/--/--/--/- HL14158/1111/(12)17/20X/Y19/208/916/1729/30 HL1422-/--/--/-(Y)/--/-(13)/--/--/- HL144311/1510/-(20)/-X/X14/1613/-15/-29/- HL144911/12(10)/1119/25X/Y17/-11/(12)15/1630/33.2

9.5 Genetischer Fingerabdruck 102

Tab.36:Fingerabdr¨uckedesSkelettkollektivsL¨ubeckPestfortgesetzt FNRD13CSFFGAAmelo-VWAD5D3D21 FNRS3171POgeninS818S1358S11 HL14628/1110/1223/(24)X/(Y)15/1811/(11)15/1730/31.2 HL146311/1210/(11)20/21X/X17/1811/1214/1628/(28) HL14648/11(9/11)(22)/-X/X19/-(12/13)14/(16)(30)/31 HL14869/1112/-24/24X/(Y)17/17(9)/11(14/18)29/- HL14878/1210/-24/-X/X14/(19)13/-16/-29/- HL1489(13)/--/--/-(X)/-(17)/--/-(15/17)-/- HL149511/(11)11/(11)20/21X/Y17/(17)(10/11)/1216/(17)30/(31) HL149710/(11)11/1221/(22)X/X19/(19)11/(11)15/1731.2/(32.2) HL150510/1111/(12)22/(22)X/X17/(17)10/1218/2030/- HL15328/(11/12)11/(11)21/22X/X15/1811/1315/17(28)/29 HL153612/(12)12/(12)(22)/-X/Y14/1611/1214/(14)30/- HL1545(11)/-(10)/-(18)/-X/Y(17/19)(11)/--/-(30)/- HL154612/-(10)/-(21/23/25)X/-(11/17)13/-15/1632.2/- HL15478/1112/1219/21X/X(13)/1813/-16/1729/- HL155314/-(10)/-20/21X/-14/1712/(12)15/16-/- HL15618/(8)(12/13)-/-X/X17/18(11/15)16/-(27/31) HL157111/1111/1218/22X/Y14/17/1911/1214/1828/- HL158911/1210/1121/26X/(Y)14/1711/-16/1830/31 HL1593(12)/--/-(20)/--/--/-(7/8)-/-(32/32.2) HL161211/(13)10/12-/-X/Y16/(17)10/1216/-28/- HL162513/-10/(12)-/--/-(15/17)-/--/-(30.2)/- HL1683-/--/-(21)/--/--/-(8/9/10)(14/15)(28.2/30/31) HL1688(8)/-10/(11)-/-(Y)/-(17)/--/-(13)/-(27/28.2/31.2)

9.5 Genetischer Fingerabdruck 103

Tab.36:Fingerabdr¨uckedesSkelettkollektivsL¨ubeckPestfortgesetzt FNRD13CSFFGAAmelo-VWAD5D3D21 FNRS3171POgeninS818S1358S11 HL169710/1212/-(19)/21X/-(13)/1813/-(15)/-31.2/- HL170112/13(10)/-23/(23)X/Y17/-(10/11)15/1629/31.2 HL170210/12(13)/-(21/23)X/Y17/(19)12/-15/1730/- HL171711/(14)10/(10)19/20X/X14/1512/(12)14/1628/30 HL172012/-10/-24/-X/X15/1611/1215/1728/- HL173012/(12)(11)/1223/24X/Y17/-12/(12)14/(18)28/- HL17419/(9)(12)/-(20)/-X/-14/(16)11/-15/(16)(28)/31 HL174911/(11)10/(11)20/(23)X/(Y)16/(17)11/1215/(15)30/- HL175112/(12)10/1220/23X/X17/1812/1315/1728/29 HL175311/(12)(10/11)21/-X/X(15)/1611/-(15/17)(28/29) HL175810/11(10/11)23/(23)X/(Y)15/1812/13(15/16/17)(30.2)/- HL175911/12(10)/11(21/22)X/X14/18(10)/12(17)/-29/30.2 HL177610/1111/(11)(20/21)X/X17/1811/1318/-(29/31.2) HL178011/1210/1121/24X/Y15/1911/1215/-28/(28) HL18008/13(11)/12(20/24)X/X15/1611/-15/1729/(31) Tab.37:GenetischeFingerabdr¨uckederIndividuenausderSkelettserieL¨ubeckHungersnot.FNR:Fundnummer;Amelo:Amelogenin,Geschlechtsmarker;-/-: Systemausgefallen;():unsicheresAllel,/-:keinzweitesAllelbeobachtet. FNRD13CSFFGAAmelo-VWAD5D3D21 FNRS3171POgeninS818S1358S11 HL1002-/--/-(23)/--/-(15)/--/--/--/-

HL1002-/--/-(23)/--/-(15)/--/--/--/-9.5 Genetischer Fingerabdruck 104

Tab.37:Fingerabdr¨uckedesSkelettkollektivsL¨ubeckHungersnotfortgesetzt FNRD13CSFFGAAmelo-VWAD5D3D21 FNRS3171POgeninS818S1358S11 HL100312/13(11/12)22/-X/Y16/1811/12(15)/1730/(32) HL110411/-(12)/-20/(22)X/X17/(20)11/-16/17(27/30) HL1105-/-(12)/--/--/-(11/14)(8)/--/--/- HL120612/149/1325/(25)X/X17/1811/1315/1828/31 HL122213/(13)10/-22/25X/X17/(17)11/(11)17/-28/(28) HL12248/(12)11/12(19)/24X/-18/(18)11/(11)16/(16)30/(31) HL138111/1312/(12)(21)/-X/X15/1711/12(14)/1830/(30) HL176611/-(10)/-(23/24)X/Y(16)/1811/12/(15)(16/19)(30/31.2) HL1817-/--/--/--/--/-(12/17)-/--/- HL1824(8)/1112/(12)20/(20)X/X17/1811/1215/1728/29 HL18258/12(9/12)24/25X/Y(17)/1812/1216/1829/(30) HL1827(10)/11(9/10)(20)/-X/Y(16)/-(12)/-(15)/-(27)/- HL182811/(11)12/(12)23/24X/X15/1712/(12)17/1828/31 HL1838-/--/--/--/--/--/--/--/- HL1843(11/12)(9/12)(19)/-X/-(14/17)(8/11)(15/16)(29/31.2) HL1871-/-(12)/--/--/-(17/20)(8)/--/--/- HL1883(8)/-(10)/-(20/25)X/-(14/17)(10/12)(15/17)(32.2/33.2) HL18848/1012/1522/(22)X/-(14/)16/1711/-15/1830/(31) HL188711/1210/1221/22X/X16/1911/1215/1730/30.2 HL1896(8/11)(11)/-(20)/-X/Y(16/18)(11/12)(15/18)(28)/- HL18998/11(11/12)22/(22)X/X16/17(7)/1216/1829/(30) HL190211/(11)(9/13)22/25X/Y15/1611/(11)14/1729/(29) HL190911/1211/(11)19/(22)X/X18/(18)11/1315/18(30)/33.2

9.5 Genetischer Fingerabdruck 105

Tab.37:Fingerabdr¨uckedesSkelettkollektivsL¨ubeckHungersnotfortgesetzt FNRD13CSFFGAAmelo-VWAD5D3D21 FNRS3171POgeninS818S1358S11 HL1920-/--/--/--/--/-(8)/--/--/- HL192211/(12)(11)/-(22/24)X/X(14)/16(7)/11(15/19)31.2/(31.2) HL193811/1310/1221/(21)X/Y17/189/1115/1829/32 HL197311/(11)9/(12)(22/24)X/(Y)17/-12/-15/1831.2/(33.2) HL19748/(9)11/1320/23X/X16/1811/1314/1530/32.2 HL19769/1112/(12)(21/23)X/Y(18)/-11/(15)(14/15)30/(30) HL1978-/--/--/--/--/-(8)/--/--/- HL198212/1412/(12)21/(21)X/-17/(17)11/(13)15/(15)(28/30.2) HL198311/(11)10/(10)20/25X/X14/1610/1216/-(31)/31.2 HL19899/1010/-18/(19)X/X16/1713/-(14)/-(29)/30 HL1991(12)/--/--/--/--/--/--/-(30)/- HL19969/1310/1323/26X/Y16/1710/1216/(16)28/30 HL1999/110/1211/(11)20/25X/Y15/1911/1215/1829/30 HL1999/28/1111/12-/-X/Y16/1811/1318/--/- HL1999/38/1112/-20/25X/X18/(19)-/-16/-(30/33.2) HL200111/12(10)/1226/-X/Y15/1611/(12)14/(16)-/- HL20458/-(11)/-(22)/--/-(14/17)(13)/--/-(31/31.2) HL205711/12(11/13)(22)/-X/-16/-11/(12)15/(19)(30/31) HL205812/1410/1120/(20)X/X14/1710/1214/1529/(33.2)

106

10 Diskussion der angewandten Methoden

10.1 Vergleich der Single-Base-Extension-Reaktion und alternativen Methoden

Zwei Methoden wurden in unserer Arbeitsgruppe zur Analyse von SNP verwen-det, die mit einer Multiplex vereinbar sind: Zum einen die Restriktions-Fragment-L¨angen-Polymorphismus-Analyse (RFLP), wie sie in der Arbeit von Puder (2005) zum Einsatz kam, zum anderen die SBE-Reaktion (Mini-Sequenzierung) in der vorliegenden Arbeit.

W¨ahrend die RFLP methodenbedingt nur die Analyse einzelner SNPs erlaubt, ist die Single-Base-Extension (SBE) die Methode der Wahl zur simultanen Ana-lyse mehrerer SNPs. Bis zu 16 verschiedene SNP wurden bereits im Multiplex-Ansatz unter Verwendung des SNaPshot Kits (Applied Biosystems) untersucht.

Bei der Kombination der SNP-Analyse mit STR-Systemen des genetischen Fin-gerabdrucks macht sich ein zweiter Nachteil der RFLP-Analyse bemerkbar: Da auch die STR-Fragmente Schnittstellen f¨ur die verwendeten Restriktionsenzyme enthalten k¨onnen, muß das PCR-Produkt f¨ur die STR-Alleldetermination jeweils vor und nach der RFLP analysiert werden. Werden zwei SNP in einer PCR ge-meinsam untersucht, muß trotz Multiplex PCR jeder SNP im eigenen Ansatz ana-lysiert werden. Die Enzyme sind teilweise in ihren Reaktionsbedingungen nicht kompatibel bzw. verursachen auch ungew¨unschte Schnitte in simultan analysier-ten SNP-Fragmenanalysier-ten. Mehrfache elektrophoretische Auftrennungen der Produk-te sind daher unumg¨anglich. Obwohl der KosProduk-tenaufwand der Restriktionsanalyse m¨aßig ist, bedeutet sie daher einen hohen Zeitaufwand.

Ein weiterer Vorteil gegen¨uber der RFLP-Analyse liegt in der gleichwertigen Dar-stellung der m¨oglichen Allele einer polymorphen Position. In der SBE werden bei-de Allele durch verschiebei-dene Farbsignale positiv nachgewiesen. Die RFLP erlaubt nur den positiven Nachweis des geschnittenen Alleles. Ein Ausbleiben des Schnit-tes hingegen l¨aßt keinen sicheren Nachweis des Gegenalleles zu. Ein Teilschnitt oder ausgebliebener Schnitt kann unter anderem Ursachen wie z. B. Degradierung der Sequenz oder unzureichende Enzymaktivit¨at haben. Bei Ver¨anderungen der Sequenz durch Degradierungsereignisse gen¨ugt im schlimmsten Falle der Defekt einer einzelnen Base, um die Restriktionsstelle unkenntlich zu machen. Eine