In situ Nachweis proliferierender Zellen und deren Charaktersierung

3.2.1 Detektion von proliferierten Zellen in situ

Besonders für immunologische Fragestellungen ist es wichtig, nicht nur zu wissen, welche Zellen proliferieren, was durchflusszytometrisch möglich ist, sondern auch die Lokalisation dieser proliferierten Zellen zu kennen. Um dies beantworten zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Technik etabliert, dies es erlauben sollte, prolifierte Zellen mittels Immunfluoreszenz nachzuweisen. Dafür sollte in einem ersten Schritt untersucht werden, ob proliferierte Zellen nicht nur mit einem Chromogenfarbstoff detektierbar sind, sondern ob sich durch eine Fluoreszenzfärbung ein ähnliches Ergebnis erzielen lässt.

Abbildung 3.3: Etablierung der Detektion von proliferierten Zellen in situ

Haut-drainierende Lymphknoten von C57BL/6 Mäusen wurden 6 Tage nach Infektion mit Leishmanien auf die Proliferation von Zellen mit Kryostatschnitten untersucht. 3 Tage vor Beendigung des Versuchs bekamen die Tiere über das Trinkwasser 0,8 mg/ml Bromdeoxyuridin (BrdU). (A) Das von proliferierenden Zellen eingebaute BrdU wurde mit einem biotinylierten Antikörper gegen BrdU detektiert. Durch Kopplung des Streptavidin-Meerrettichperoxidase Komplexes an den biotinylierten Antikörper kann eine Umsetzung des Substrates 3,3' Diaminobenzidin (DAB) erfolgen. Die BrdU⁺ Zellen sind braun-rot gekennzeichnet. Die schwarzen Pfeile zeigen die dichte Anhäufung dieser Zellen. Als Gegenfärbung wurde Hämatoxylin verwendet. (B) Fluorochrombasierte Darstellung von BrdU⁺ Zellen. Hier wurde anstelle des Streptavidin-Meerrettichperoxidase Konjugates (A) ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiertes Streptavidin verwendet. Die Gegenfärbung erfolgte mit DAPI.

Auch hier zeigen die Pfeile die dichte Struktur dieser Zellen an. Die Daten sind repräsentativ für vier Experimente. (Maßstabsbalken: 100 µm).

Um diese Frage zu klären, erhielten die Tiere für einen Zeitraum von drei Tagen vor dem Ende des Versuchs mit dem Trinkwasser 0,8 mg/ml des Thymidinanalogon Bromdexyuridin (BrdU). Die Lymphknoten wurden wie unter 2.2.1.9 in den Material und Methoden beschrieben präpariert. Von den poplietalen Lymphknoten dieser 6 Tage infizierten C57BL/6 Mäuse wurden Kryostatschnitte angefertigt. Proliferierte Zellen können auf diesen Schnitten, wie in Abbildung 3.3 gezeigt und vom Hersteller angegeben (BD Pharmingen, Katalognummer 550803) mit einem Chromogenfarbstoff dargestellt werden. 8 m dicke Kryostatschnitte wurden laut Herstellerprotokoll mit einem biotinylierten anti-BrdU Antikörper und anschließend mit einer an Streptavidin gebundenen Meerrettichperoxidase inkubiert. Durch Zugabe von 3,3' Diaminobenzidin (DAB) wird dieses von der Peroxidase in einen braun-rötlichen Farbstoff umgesetzt (Abb. 3.3A). Alternativ sollte im Rahmen dieser Arbeit ein Protokoll entwickelt werden, das es erlaubt, wie in Abbildung 3.3B gezeigt, proliferierende Zellen mit fluoreszenten Antikörpern zu detektieren. Dafür wurde der Kryostatschnitt eines Lymphknotens ebenfalls mit biotinylierten anti-BrdU Antikörpern inkubiert. Anschließend wurde der Schnitt mit fluoreszenten Streptavidin-AlexaFluor 546 inkubiert. Auch bei dieser Immunfluoreszenzfärbung sind die dicht angeordneten proliferierten Zellen erkennbar. Abbildung 3.3 zeigt, dass proliferierte Zellen vergleichbar mit beiden Protokollen dargestellt werden können.

Die hier gezeigte fluoreszenzbasierte Methode erlaubt es nun, den Phänotyp der BrdU⁺ Zellen näher zu charkterisieren (84). Jedoch musste vorher noch geklärt werden, ob eine fluoreszenzbasierte Oberflächenfärbung zusammen auf einem Kryostatschnitt mit einer für die BrdU-Färbung notwendigen DNS-Denaturierung möglich ist. Diese Problematik und deren Lösung werden im folgenden Abschnitt behandelt.

3.2.2 Charakterisierung proliferierter Zellen in situ

Wie bereits erwähnt, würde eine simultane Detektion von in die DNS eingebautem BrdU zusammen mit zellspezifischen Oberflächenmolekülen die Phänotypisierung einer BrdU⁺ und somit proliferierten Zelle in situ erlauben. Dafür wurde innerhalb dieser Arbeit der „BrdU in situ Detection Kit“ von BD Pharmingen modifiziert (84). Bei

diesem Protokoll werden zur Denaturierung der DNS die Kryostatschnitte 10 Minuten bei 89 °C in einem Citrat-haltigen Puffer inkubiert (siehe 2.2.1.9 in Material und Methoden). Eine derartige Behandlung hat zur Folge, dass Antikörper ihre entsprechenden Epitope nicht mehr detektieren können, wie in Abbildung 3.4 gezeigt. Die Färbebilder von Kontrollschnitten (ohne Hitzebehandlung) zeigen eine distinkte Färbung von CD4⁺ T-Zellen im Paracortex, wohingegen eine Inkubation mit einem anti-CD4 Antikörper nach dem Hitzeschritt ein für T-Zellen untypisches Färbemuster ergibt. So kommt es zum teilweisen Verlust des Nachweises CD4⁺ Zellen (siehe Abb. 3.4E). Zudem werden Strukturen (siehe Pfeile Abb. 3.4B) als falsch positiv dargestellt, was mit der Änderung der Tertiärstruktur der Oberflächenmoleküle zu tun haben könnte. Eine Oberflächenfärbung nach der Denaturierung zeigte sich zielführend, wie in Abbildung 3.4F zu sehen ist.

Nachdem die Abfolge der Färbeschritte geklärt war, stellte sich die Frage, welche Fluorochrome einen derartigen Schritt überstehen. Fluorochrome wie AlexaFluor488, Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC) führen zu unspezifischen Färbungen wie in Abbildung 3.4C stellvertretend für AlexaFluor488 gezeigt. Dagegen können mit FITC, AlexaFluor647 oder Cy5 konjugierte Antikörper für eine derartige Methode verwendet werden, da sie zu vergleichbaren Färbemustern führten wie eine Kontrollfärbung ohne Hitzeschritt (siehe Abb. 3.4F eine Färbung stellvertretend mit Cy5 konjugiertem anti-CD4 Antikörper).

Dadurch ist es nun möglich, BrdU⁺ Zellen fluorochrom-basiert darzustellen und sie phänotypisch zu charakterisieren, wenn vor der DNS-Denaturierung eine Oberflächenfärbung erfolgt. Durch die Etablierung dieses Protokolls, war es möglich, im Verlauf dieser Arbeit während einer Infektion mit L. major bestimmte Kompartimente im Lymphknoten auf die darin proliferierenden Zelltypen hin zu untersuchen.

Abbildung 3.4: Etablierung einer Doppelfärbung von BrdU⁺ Zellen

Kryostatschnitte eines poplitealen Lymphknotens wurden mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern bei verschiedenen Ansätzen inkubiert. (A) Eine Kontrollfärbung mit AlexaFluor 488 konjugiertem anti-CD4 Antikörper ist hier gezeigt. Eine Inkubation bei 89 °C zur DNS-Denaturierung wurde nicht durchgeführt. (B) Eine Oberflächenfärbung nach dem 89 °C Hitzeschritt zeigt unspezifische Färbungen, siehe Pfeile. (C) Auch eine Färbung vor dem Hitzeschritt führt zu einer unspezifischen Färbung, wie durch Pfeile angedeutet ist. (D) Kontrollfärbung mit einem Cy5-konjugiertem anti-CD4 Antikörper ohne Hitzeschritt von 89 °C. (E) Eine Färbung nach dem Hitzeschritt zeigt, dass im Vergleich zu (D) weniger Zellen gefärbt sind. (F) Bei einer Färbung vor dem Hitzeschritt von 89 °C zeigt sich eine vergleichbare Färbung wie bei der Kontrollfärbung (D). Diese Abbildung ist exemplarisch für 3 Experimente. (Maßstabsbalken A-C: 100 µm, D-F: 50 µm).