Durchflusszytometrie (FACS – Analyse)

Das Verfahren der Durchflusszytometrie erlaubt die Analyse von Zellsuspensionen auf Einzelzellebene. Es beruht darauf, dass Zellen einzeln hintereinander durch eine Durchflusskammer des FACS-Gerätes den Lichtstrahl eines oder mehrerer Lasers passieren. Die Vorwärtsstreuung korreliert dabei mit der Zellgröße, während die seitliche Streuung ein Maß für die zelluläre Granularität darstellt. Mittels fluoreszenz-markierte Antikörper kann man verschiedene Proteine auf einer Zelle oder auch innerhalb einer Zelle nachweisen. Die Fluoreszenzfarbstoffe, die mit einem FACS – Calibur analysiert werden können, werden entweder durch einen Argon – Ionen – Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm oder durch einen roten Dioden – Laser mit einer Wellenlänge von 635 nm angeregt. In der vorliegenden Arbeit wurden folgende Fluorochrome verwendet:

1. Fluorescein – Isothiocyanat (FITC) bzw. AlexaFluor 488 2. Phycoerythrin (PE)

3. Peridinin – Chlorophyll – Protein (PerCP)

4. Allophycocyanin (APC), Cy5 oder AlexaFluor 647

Die Fluoreszenzintensität ist direkt proportional zur Anzahl der zu untersuchenden Moleküle auf oder in einer einzelnen Zelle. Ausgewertet wurden die Daten entweder in einem Histogramm (Einparameterdarstellung) oder in einem Dotplot (Zweiparameterdarstellung).

Analyse der Expression von Oberflächenmolekülen

In der vorliegenden Arbeit wurden Zellen aus dem poplitealen Lymphknoten mittels FACS untersucht. Dazu wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt und aus diesen 5x10⁵ Zellen in ein FACS – Röhrchen überführt und pelletiert (300g, 5 Minuten, 4

°C). Damit eventuelle Zellverluste bei der Färbung zurückgerechnet werden konnten, werden pro FACS-Röhrchen ca. 10000 Latex-Kugeln zugegeben. Um unspezifische Anlagerungen von Färbeantikörpern zu verhinden, wurden die Fc-Rezeptoren auf den Zellen mit 20 g/ml Cohn II für 20 Minuten bei 4 °C geblockt. Zum Waschen der

Zellen wurden nach jedem Inkubationsschritt 1 ml FACS – Puffer hinzugegeben und die Proben 5 Minuten bei 300 g und 4 °C zentrifugiert. Anschließend wurden die jeweiligen Antikörper in FACS-Puffer verdünnt zu den Proben hinzugegeben und für 20 Minuten bei 4 °C inkubiert. Bei Mehrfachfärbungen wurden alle Antikörper gleichzeitig auf die Zellen pipettiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde, falls nötig, noch einmal für 20 Minuten bei 4 °C mit einem fluoreszenten Streptavidin-Konjugat gefärbt. Nach der Färbung erfolgte die Aufnahme der Zellen mit einem FACSCalibur Flow Cytometer. Ausgewertet wurden die Ergebnisse mit der Software FlowJo.

Zur Auswertung wurden innerhalb der Zweiparameterdarstellung die Latex-Kugeln anhand ihrer Größe und somit deren Anzahl bestimmt. Aus dem Verhältnis eingesetzter Latex-Kugeln zu tatsächlich am Gerät aufgenommener Kugeln lässt sich berechnen, wie viele Kugeln während des Färbevorgangs verloren gingen. Mit diesem Prozentsatz wiederum kann man auf die im FACS-Röhrchen enthaltenen Zellen der einzelnen Populationen zurück rechnen. Da in jedes FACS-Röhrchen 500.000 Zellen pipettiert worden sind, kann man den Quotienten bilden aus Zellzahl des kompletten Organs und den in das FACS-Röhrchen pipettierten Zellen. Mit diesem Quotienten multipliziert man anschließend die Zellzahl der Population, die sich im FACS-Röhrchen befunden hat und erhält somit die Anzahl der Zellen im ganzen Organ.

Eine alternative Methode ist die prozentuale Auswertung einer Zellpopulation in Bezug zu allen in dem FACS-Röhrchen befindlichen Zellen.

Analyse des in vivo – BrdU – Einbaus

Zum Nachweis der Proliferation von Zellen in vivo kann man den Tieren über ihr Trinkwasser das Thymidinanalogon BrdU verabreichen. Dieses wird von sich teilenden Zellen in die neusynthetisierte DNS eingebaut, dieses eingebaute BrdU kann nun mittels eines Antikörpers detektiert werden und somit proliferierte Zellen bestimmt und mit einer Oberflächenfärbung charakterisiert werden.

Zuerst wurde wie oben beschrieben eine Oberflächenfärbung durchgeführt. Um einen Aufschluss der Zellen zu erreichen, damit der anti-BrdU-Antikörper in die Zelle gelangen kann, wurden die Zellen mit 100 l Cytofix/Cytoperm für 30 Minuten im Dunkeln und bei RT inkubiert. Danach wurde mit 1 ml Perm/Wash-Puffer wie üblich

gewaschen. Zum Aufbrechen des Zellkerns wurden die Zellen mit 100 l PBS/1 % BSA/0,01 % Triton-X100 für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem erneuten Waschschritt wurden die Zellen nochmals mit 100 l Cytofix/Cytoperm 5 Minuten bei RT inkubiert. Nach dem Waschschritt erfolgte die Inkubation mit 30 g DNAse / 100

l PBS für eine Stunde bei 37 °C. Damit wurde die DNS verdaut, um die Bindungsstellen für den Antikörper frei zu legen. Nach dem Waschen wurden 2,5 l FITC-konjugierter anti-BrdU-Antikörper zum Zellpellet pipettiert. Der Ansatz wurde zum Mischen geschüttelt und 20 Minuten bei RT inkubiert. Nach dem letzten Waschschritt wurden die die Zellen in 200 l FACS-Puffer aufgenommen und im Durchflusszytometer analysiert.

Zellseparation mittels Durchflusszytometrie

Zellen können mit verschiedenen Methoden in Populationen aufgetrennt werden.

Eine dieser Methoden ist die Zellseparation mittels eines FACSAria Durchflusszytometers. Dabei werden die Zellen aufgrund von Oberflächenmolekülen, gegen welche eine Antikörperfärbung im Vorfeld durchgeführt wurde, separiert.

Für eine Zellseparation wurde zunächst eine Einzelzellsuspension aus Lymphknoten hergestellt. Diese Zellen wurden auf eine Zellzahl von 15 Millionen Zellen pro 500 l in einem FACS-Röhrchen eingestellt. Nach dem Blocken mit Cohn II wurde eine Antikörperfärbung mit anti-CD4 PE (1:100) und anti-CD19 AlexaFluor 647 (1:200) durchgeführt. Nachdem die Zellen nochmals mit 1 ml FACS-Puffer gewaschen wurden, wurden sie in 500 l aufgenommen, durch ein Sieb gespült und sortiert.

Dabei erfolgte eine Auftrennung der Populationen nach CD4⁺ T-Zellen, CD19⁺ B Zellen und CD4⁺ CD19⁺ doppelpositiven Konjugaten. Diese Konjugate wurden pelletiert und in einem 20 mM EDTA-haltigen FACS-Puffer aufgenommen. Dadurch kam es zur Trennung der Konjugate. Bei einer nochmaligen Zellseparation mittels Durchflusszytometer wurden die Populationen schließlich in CD4⁺ T-Zellen und CD19⁺ B Zellen aufgetrennt. Aus diesen Zellen erfolgte die Isolierung der RNA.