2.4 Gangliosid-Analytik
2.4.4 Immun-Overlay Verfahren
Desaga Densitometer CD60 im Remissionsmodus
Im Vergleich zur soeben beschriebenen Methode wurden die HPTLC-Platten mit dem Densitometer CD6037 vermessen. Die Chromatogramme wurden bei dieser Methode mit monochromatischem Licht angeregt und die Remission wurde detek-tiert (Anregungswellenl¨angen siehe Tabelle 2.10). Die Auswertung der Meßdaten erfolgte PC-gest¨utzt mit der integrierten Software der Firma Desaga.
BCIP BCIP
BCIP BCIP
BCIP BCIP
BCIP BCIP
BCIP BCIP
BCIP BCIP BCIP
GSL4
A B
5
5 4 3 2 4
3
1 GSL3 1
GSL2
GSL1
GSL4
GSL3
GSL2
GSL1
Abbildung 2.1: Schema des HPTLC-Immun-Overlay Assays mit Anti-Gangliosid-Antik¨orpern (A) und mit Gangliosid-bindenden Zellen (B).
1: HPTLC-Trennung von Gangliosid-Gemischen, 2: Adh¨asion von Zellen an Rezeptor-Ganglioside,
3: Prim¨arantik¨orper (A: gegen Gangliosid-Epitope gerichtet,
B: gegen Epitope der Zelloberfl¨ache gerichtet), 4: Alkalische Phosphatase (AP)-markierter Sekund¨arantik¨orper, 5: Farbniederschlag durch Substrat-Umsetzung (BCIP).
Plexiguml¨osungen
Stamml¨osung 15 g Plexigum P-28 in 100 mL Chloroform
Gebrauchsl¨osung 0,5% Plexigum in n-Hexan (¨uber Molekularsieb getrocknet) entspricht einer 1:30-Verd¨unnung der Stamml¨osung
Chromatogramm-Vorinkubation
Um die Konzentration der aus dem Laufmittel stammenden Ca2+-Ionen im Silika-gel der HPTLC-Platten zu vermindern, wurden die D¨unnschichtchromatogramme u.N. in CMF-PBS Puffer (Ca¨ 2+/Mg2+-free Phosphate buffered saline) bei 37◦C vorinkubiert und dann dreimal mit PBS-Tween gewaschen (Olbrich, 2001).
Zur Durchf¨uhrung der Immun-Overlay Tests wurden die beiden Puffer CMF-PBS und HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N-(2-ethansulfon S¨aure)39) ein-gesetzt.
39Art.-Nr. H4034
Puffer
CMF-PBS 140 mM NaCl 2,7 mM KCl 8,5 mM Na2HPO4
1,5 mM KH2PO4 in Wasser, pH 7,4
HEPES 10 mM HEPES
150 mM NaCl 5 mM CaCl2
in Wasser, pH 7,4 L¨osungen
Waschpuffer 0,05% Tween 21 (w/v) in Puffer Abs¨attiger 1% BSA (w/v) in Puffer Glycinpuffer 0,1 M Glycin/HCl
1 mM ZnCl2
1 mM MgCl2
in Wasser, pH 10,4 (NaOH-Pl¨atzchen) Substratl¨osung 0,05% BCIP in Glycinpuffer
Prim¨arantik¨orper und E-Selektin-IgG Chim¨are
Der Prim¨arantik¨orper JM07/193 (mAk) und die E-Selektin-IgG Chim¨are JM08/-35-2 wurden von Herrn Dipl.-Biol. A. Werner und der mAk KM93 von Frau Prof. Dr. T. Feizi40 zur Verf¨ugung gestellt. Der Ziege-Antik¨orper gegen rekombi-nantes, humanes E-Selektin41 sowie alle weiteren Antik¨orper wurden von Herrn PD Dr. J. M¨uthing bereitgestellt.
Die Prim¨arantik¨orper wurden f¨ur den Immun-Overlay Assay in Konzentrationen von 1:1000 eingesetzt. Die E-Selektin-IgG Chim¨are sowie der CSLEX1-Antik¨orper wurden in einer Konzentration von 10µg/mL verwendet. Der polyklonale Anti-E-Selektin Antik¨orper wurde durch Immunisierung einer Ziege mit rekombinantem
40The Glycoscience Laboratory Northwick Park Hospital, Harrow, UK
41Art.-Nr. BBA 18, R & D Systems GmbH, Wiesbaden, D
Tabelle 2.11: F¨ur die Immun-Overlay Verfahren und Immunfluoreszenzf¨arbungen eingesetzte Prim¨arantik¨oper und die E-Selektin-IgG Chim¨are.
Bezeichnung Antik¨orper Antigenspezifit¨at Herkunft
JM07/193, CSLEX1 IgM, Maus sLex
JM08/35-2, Selektin, Maus sLex
(E-Selektin-IgG Chim¨are) IgG, Mensch
KM93 IgM, Maus sLex
CDw65 (Klon 88H7) IgM, Maus VIM-2
JM06/280-4 Antiserum, Huhn IV3Neu5Ac-nLcOse4Cera JM06/280-5 Antiserum, Huhn IV6Neu5Ac-nLcOse4Cera
JM07/28 pAk, Ziege E-Selektin (h)
ahergestellt gegen diese Tetraose-Struktur, der Antik¨orper reagiert aber auch mit Ganglio-siden mit l¨angerem Oligosaccharidanteil.
humanem E-Selektin hergestellt. Er konnte jedoch auch zum Nachweis von na-tivem humanem und murinem E-Selektin eingesetzt werden, da der polyklonale Antik¨orper diesbez¨uglich Kreuzreaktivit¨aten besitzt.
F¨ur die Immunfluoreszenz-F¨arbung von Zellen (siehe Abschnitt 2.6.3) wurde der Anti-E-Selektin Antik¨orper (JM07/28) in einer 1:500-Verd¨unnung eingesetzt.
CSLEX1 Antik¨orper
Der CSLEX1 produzierende Zellklon HB-8580 wurde von der amerikanischen Zellkultursammlung ATCC (American Type Culture Collection) bezogen. Die Hybridoma Zellen sind das Fusionsprodukt von P3X63Ag8.653 Myelomzellen mit Milzzellen von BALB/c-M¨ausen, die mit Membranproteinen aus Magen-Adenokarzinomgewebe des Menschen immunisiert wurde (ATCCURL). Der mo-noklonale Antik¨orper vom IgM-Typ wird in das Medium sezerniert und konnte aus dem Zellkultur¨uberstand gewonnen werden. Die Konzentration des Antik¨orpers wurde nach Ultrafiltration zu 1µg/µL bestimmt ((JM07/193); Werner, 2001).
E-Selektin-IgG Chim¨are
Die E-Selektin-IgG Chim¨are ist ein genetisches Konstrukt aus dem konstanten Teil des humanen IgG1 und dem E-Selektin der Maus, das durch die Methode der
Tabelle 2.12: F¨ur die Immun-Overlay Verfahren und Immunfluoreszenzf¨arbungen eingesetzten Sekund¨arantik¨orper.
Art.-Nr.
Sekund¨arantik¨orpera Antigenspezifit¨at
(Dianova) AP-Ziege Maus IgG + IgM (H + L) 115-055-044 AP-Kaninchen Mensch IgG (H + L) 309-055-003 AP-Kaninchen Huhn IgY (IgG) (H + L) 303-055-003 AP-Kaninchen Ziege IgG (H + L) 305-055-003 DTAF-Maus Ziege IgG (H + L) 205-015-108
aDie Antik¨orper wurden von der Firma Jackson Immuno Research (Baltimore, USA) herge-stellt und von Dianova (Hamburg, D) bezogen. Sie lagen in affinit¨atschromatographischer Reinheitsstufe vor.
Elektroporation in einem Plasmid in die Myelomzelle J558 eingebracht wurde (Hahne et al., 1993). Das chim¨are Protein wird von der Myelomzelle in den Uberstand sezerniert (JM08/35-2).¨
Von dem Carboxy-Terminus des humanen Immunglobulin ausgehend (CH3- und CH2-Dom¨ane mit Verkn¨upfungsregion (Hinge Region)) beginnt der murine Teil des chim¨aren Molek¨uls mit zwei SCR-Dom¨anen (Short Consensus Repeats). Dar-an schließt sich die EGF-Dom¨Dar-ane (Epidermal Growth Factor) Dar-an, gefolgt von der Lektin-¨ahnlichen Dom¨ane, die mit dem Amino-Terminus endet (Schemazeichnung mit Dom¨anenstruktur siehe Abbildung 1.2).
Sekund¨arantik¨orper
Die AP-markierten Sekund¨arantik¨orper wurden f¨ur den Immun-Overlay Test in Konzentrationen von 1:1000 eingesetzt. Der DTAF-markierte Ziege-anti-Maus Antik¨orper f¨ur die Immunfluoreszenz-F¨arbung von Zellen wurde 1:500 verd¨unnt und weist eine Kreuzreaktivit¨at gegen Mensch und Kaninchen auf. Die Inkuba-tionsschritte der HPTLC-Platten erfolgten in den in Tabelle 2.13 angegebenen Volumina.
Durchf¨uhrung
Bei der Durchf¨uhrung der Immun-Overlay Tests wurden, je nach Antik¨orper/Anti-gen-Reaktion, zwei unterschiedliche Puffersysteme verwendet. Der HEPES-Puffer
Tabelle 2.13:Inkubationsvolumina f¨ur HPTLC-Platten beim Immun-Overlay Ver-fahren und beim Zelladh¨asionstest.
HPTLC Platte Overlay-Test Zelladh¨asions-Test
[cm×cm] [mL] [mL]
10×10 20 −a
10× 5 10 15
10× 1 6 5
aF¨ur diese HPTLC-Plattengr¨oße wurde keine Zell-Zentrifugationskammer hergestellt.
Tabelle 2.14: Die Arbeitsschritte des HPTLC-Immun-Overlay Verfahrens.
Schritt Zeit/Anzahl Arbeitsschritt
1 10 min Abs¨attigen mit BSA-Puffer 2 1 h Inkubation mit Prim¨arantik¨orper
bzw. E-Selektin-IgG Chim¨are in BSA-Puffer
3 3× 1 min Waschen mit Tween-Puffer
4 1 h Inkubation mit Sekund¨arantik¨orper in BSA-Puffer
5 3× 1 min Waschen mit Tween-Puffer 6 1× 1 min Waschen mit Glycinpuffer 7 variabel Inkubation mit Substratl¨osung 8 2× 1 min Waschen mit Glycinpuffer
enth¨alt Ca2+-Ionen, die f¨ur die Ca2+-abh¨angige Bindung von E-Selektin an seinen Rezeptor essentiell sind. Deshalb wurden f¨ur die L¨osungen mit der E-Selektin-IgG Chim¨are und den E-Selektin-exprimierenden CHO-E Zellen (siehe Abschnitt 2.7.2) dieses Puffersystem eingesetzt. Die anderen Immun-Overlay Tests wurden mit in CMF-PBS (Ca2+/Mg2+-freie Phosphat-gepufferte Kochsalzl¨osung) aufge-nommenen Antik¨orpern durchgef¨uhrt.
Die verwendeten Sekund¨arantik¨orper waren mit dem Enzym Alkalische Phospha-tase gekoppelt. Bei einem pH Wert-Optimum von 10,4 katalysiert dieses Enzym die Abspaltung der Phosphatgruppe aus dem Substrat BCIP42 zu dem entspre-chenden Indolderivat, welches nach der Oxidation durch Luftsauerstoff dimerisiert und als Indigofarbstoff ausf¨allt.
42Art.-Nr. 02291, Biomol Feinchemikalien GmbH, Hamburg, D
F¨ur die Inkubationsschritte wurden Kammern und Deckel aus Plexiglas verwen-det, die mit den in Tabelle 2.13 aufgelisteten Volumina beschickt wurden. Nur f¨ur die Immun-Overlay Tests (nicht f¨ur die Zelladh¨asionstests) wurde den Puf-fern 0,02% Natriumazid (w,v) zugesetzt, um das Wachstum von Bakterien zu verhindern.